2012年鐵死亡被發(fā)現(xiàn)后，它的相關(guān)研究經(jīng)歷了指數(shù)級(jí)的增長(zhǎng)，也是近幾年熱門中的 “熱門"。小優(yōu)曾用3篇文章詳細(xì)的剖析過它，從研究歷程到正式命名，再到通路研究，都有詳細(xì)解讀，不清楚的同學(xué)可以戳鏈接再了解。

在今年的3月17日，美國(guó)Broad研究所Todd R. Golub研究組與Peter Tsvetkov合作在Science上發(fā)表了題為“Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins" 的研究文章。文章一經(jīng)發(fā)布，“銅死亡"一詞迅速霸屏?？梢灶A(yù)見，未來幾年，銅死亡的相關(guān)研究，也會(huì)迎來“井噴式"爆發(fā)。

為了方便各位快速了解銅死亡，大家拿好小板凳做好，小優(yōu)課堂馬上就要開課了。

本文核心觀點(diǎn)：
1. 揭示了一種新的細(xì)胞死亡機(jī)制——銅死亡，證明銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是由蛋白質(zhì)脂?；閷?dǎo)的 
2. 銅死亡是通過銅與TCA循環(huán)的脂酰化成分直接結(jié)合而發(fā)生的，這導(dǎo)致脂酰化蛋白質(zhì)聚集，以及鐵硫簇蛋白質(zhì)丟失，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡
3. FDX1是蛋白質(zhì)脂?；纳嫌握{(diào)節(jié)因子，F(xiàn)DX1和蛋白質(zhì)脂酰化是銅死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子

Over！接下來讓我們細(xì)細(xì)研磨這篇文章的精華，感受高分文章的魅力所在吧！

銅是所有生物體不可少的輔助因子，通過跨濃度梯度起作用的主動(dòng)穩(wěn)態(tài)機(jī)制可以將細(xì)胞內(nèi)銅濃度保持在非常低的水平，以防止對(duì)細(xì)胞有害的游離銅的累積。不過銅穩(wěn)態(tài)的遺傳變異會(huì)導(dǎo)致致命的疾病，并且銅離子載體和銅螯合劑都被認(rèn)為是抗癌劑。然而，過量的銅如何誘導(dǎo)細(xì)胞死亡尚不清楚。

銅離子載體是與銅結(jié)合的小分子，可以將銅運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)，因此是研究銅毒性的有用工具。多條證據(jù)表明，銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)制涉及細(xì)胞內(nèi)銅的積累，而不是小分子伴侶本身的作用。

一、銅離子載體誘導(dǎo)一種特別形式的受調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡

為了確定銅離子載體的細(xì)胞毒性是否依賴于銅本身，研究人員首先利用Elesclomol這種銅離子載體驗(yàn)證了僅有銅離子能夠介導(dǎo)細(xì)胞的死亡，而搭載其他金屬離子時(shí)不具備對(duì)細(xì)胞殺傷的活性。接下來驗(yàn)證了銅離子介導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)制，通過凋亡的標(biāo)志物檢測(cè)，以及凋亡或鐵死亡的抑制劑均不能抑制銅離子所介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，這表明銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡很可能是一種新的細(xì)胞死亡途徑，明顯區(qū)別于傳統(tǒng)的凋亡、鐵死亡和壞死等細(xì)胞死亡方式。

圖1：銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡與傳統(tǒng)死亡途徑不同

A：在489個(gè)細(xì)胞系中測(cè)試了1448個(gè)載銅藥物對(duì)細(xì)胞的殺傷效果，結(jié)果表明這些載銅藥物均能殺傷細(xì)胞
B：?jiǎn)为?dú)加入Elesclomol不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，而一旦加入銅離子，細(xì)胞生長(zhǎng)受到極大抑制。相反，加入其他金屬，例如鐵鈷鋅鎳等也不影響細(xì)胞生長(zhǎng)
C：用濃度低至40nM的銅離子載體Elesclomol脈沖處理，2ｈ細(xì)胞內(nèi)銅水平增加15至60倍，超過24小時(shí)后引發(fā)細(xì)胞死亡。該結(jié)果表明銅介導(dǎo)的細(xì)胞死亡確實(shí)受到調(diào)節(jié)
D、E：Elesclomol誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡不涉及caspase 3活性的切割或激活
F、G：當(dāng)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)子BAX和BAK1被敲除或當(dāng)細(xì)胞與泛半胱天冬酶抑制劑共處理時(shí)，Elesclomol仍能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，再次表明銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡與細(xì)胞凋亡不同
G、H：銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡與已知細(xì)胞死亡機(jī)制不同

二、線粒體呼吸調(diào)節(jié)銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡

研究人員觀察到更依賴線粒體呼吸的細(xì)胞對(duì)銅離子的敏感性比進(jìn)行糖酵解的細(xì)胞高近1000倍。如果采用藥物干預(yù)線粒體功能后，細(xì)胞對(duì)銅離子的敏感性發(fā)生顯著變化。通過乏氧條件培養(yǎng)細(xì)胞，研究人員進(jìn)一步證實(shí)了銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡需要線粒體呼吸參與，而糖酵解產(chǎn)生的ATP方式，對(duì)銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡影響較小。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，用銅離子載體處理不會(huì)顯著降低基礎(chǔ)呼吸或ATP相關(guān)呼吸，但會(huì)顯著降低呼吸的儲(chǔ)備能力，這表明銅不直接靶向ETC，而是靶向TCA循環(huán)的組成部分。

圖2：線粒體呼吸調(diào)節(jié)銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡

A：更依賴線粒體呼吸的細(xì)胞對(duì)銅離子的敏感性比進(jìn)行糖酵解的細(xì)胞高近1000倍
B：用線粒體抗氧化劑等處理，對(duì)銅離子載體的敏感性具有非常明顯的影響。ETC的復(fù)合體I/II的抑制劑以及線粒體丙酮酸攝取的抑制劑能減少細(xì)胞死亡，但對(duì)鐵死亡沒有影響
C：線粒體解偶聯(lián)劑FCCP對(duì)銅毒性沒有影響，這表明銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡需要線粒體呼吸
D：低氧條件下，銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡減弱，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞呼吸在介導(dǎo)銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中的作用
E：銅不直接靶向ETC而是靶向TCA循環(huán)的組成部分
F：銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和線粒體代謝之間的聯(lián)系

三、FDX1和蛋白硫辛?；倾~離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子

為進(jìn)一步研究銅離子和 TCA 循環(huán)之間的聯(lián)系，研究人員使用 CRISPR-Cas9 技術(shù)，分別敲除不同的基因，再使用銅離子載體處理細(xì)胞，以確定涉及參與銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有7個(gè)基因的敲除可以明顯緩解銅離子載體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用，包括 FDX1，LIPT1、LIAS、DLD (硫辛酸途徑的三個(gè)關(guān)鍵酶)，DLAT、PDHA1、PDHB (丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的三個(gè)組分)。另外，敲除 FDX1 和 LIAS 基因明顯減輕銅離子載體引起的細(xì)胞毒性，這進(jìn)一步加強(qiáng)了FDX1和銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡之間的功能聯(lián)系，也因此，研究人員猜測(cè) FDX1 有可能是蛋白質(zhì)硫辛?；揎椀纳嫌握{(diào)節(jié)因子。

圖3：FDX1 和蛋白硫辛?；倾~離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子

A-C：敲除了不同基因后，細(xì)胞參與銅離子載體誘導(dǎo)的死亡的基因（藍(lán)色）
D：硫辛酸通路的示意圖
E：代謝酶篩選顯示，復(fù)合物I的基因抑制也使細(xì)胞免于銅誘導(dǎo)的死亡
F、G： FDX1和LIAS的缺失賦予了對(duì)銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的抵抗力

四、FDX1 是蛋白質(zhì)硫辛酰化的上游調(diào)節(jié)因子

為了驗(yàn)證上述猜測(cè)，研究人員首先通過檢索公共數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)FDX1和硫辛酸代謝相關(guān)蛋白在銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡方面是高度相關(guān)的。其次，對(duì)208例人類腫瘤樣本進(jìn)行了FDX1和硫辛酰化蛋白的免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)FDX1和硫辛酰化蛋白的表達(dá)高度相關(guān)。之后，通過免疫印跡和免疫組織化學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)敲除FDX1會(huì)導(dǎo)致DLAT 和 DLST 蛋白的硫辛酰化*喪失，同時(shí)也導(dǎo)致細(xì)胞呼吸水平顯著下降。這些結(jié)果均表明FDX1是蛋白質(zhì)硫辛?；纳嫌握{(diào)節(jié)因子。

圖4：FDX1 是蛋白質(zhì)硫辛?；纳嫌握{(diào)節(jié)因子

A：FDX1 敲除的相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)
B-C：腫瘤樣本的 FDX1 和硫辛酰化蛋白的免疫組化染色
D：敲除 FDX1，檢測(cè)硫辛酰化蛋白的表達(dá)量
E：敲除 FDX1 ，檢測(cè)細(xì)胞耗氧率
F：敲除 FDX1，檢測(cè)與硫辛?；緩较嚓P(guān)的代謝物的變化

五、銅直接結(jié)合并誘導(dǎo)硫辛?；?DLAT 的寡聚化

上述實(shí)驗(yàn)已經(jīng)建立了銅毒性和蛋白質(zhì)硫辛酰化之間的聯(lián)系，但沒有確定直接的機(jī)制。有研究報(bào)道銅離子與游離脂酸的解離常數(shù)為 10–17，這表明銅離子有可能直接與硫辛?；鞍捉Y(jié)合。

為了驗(yàn)證這一猜想，研究人員純化了DLAT和DLST蛋白，發(fā)現(xiàn)二者都可以與偶聯(lián)銅的樹脂結(jié)合。而敲除FDX1會(huì)導(dǎo)致DLAT蛋白的硫辛酰化修飾消失，且 DLAT和DLST也不再與偶聯(lián)銅的樹脂結(jié)合。這表明蛋白質(zhì)的硫辛?；揎検墙Y(jié)合銅的必要條件。此外，銅與硫辛酰化蛋白 DLAT 的結(jié)合，會(huì)導(dǎo)致蛋白的寡聚化，而 Elesclomol 處理會(huì)增加 DLAT 蛋白的寡聚化。

圖5：銅直接結(jié)合并誘導(dǎo)硫辛?；?DLAT 的寡聚化

A：細(xì)胞提取蛋白和偶聯(lián)銅的樹脂的結(jié)合
B-E：IB 分析 DLAT 蛋白寡聚化
F-H：強(qiáng)還原劑TCEP處理，表明寡聚體是二硫鍵依賴性的

六、銅誘導(dǎo)細(xì)胞死亡機(jī)制與銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)的遺傳模型相同

為了探討與銅離子載體治療相關(guān)的銅毒性機(jī)制是否與這些自然發(fā)生的銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)有關(guān)，研究人員檢查了三個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｊ紫?，在HEK 293T和ABC1細(xì)胞中過表達(dá)SLC31A1，這顯著增加了對(duì)生理銅濃度的敏感性。另外，過表達(dá) SLC31A1 的細(xì)胞被銅離子載體處理后，蛋白硫辛?；瘻p少，F(xiàn)e-S簇蛋白水平降低，HSP70 水平升高。

在過表達(dá)SLC31A1的細(xì)胞中，鐵死亡、壞死性凋亡和凋亡抑制劑并不能阻止銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，而銅螯合劑、FDX1敲除和LIAS敲除各自部分卻可緩解銅離子載體產(chǎn)生的細(xì)胞殺傷作用。

最后，使用老年 ATP7B 缺陷小鼠 (Atpb7b?/?，銅失調(diào)綜合征 Wilson’s disease 模型) 與雜合子 (Atpb7b+/?) 和野生型對(duì)照小鼠對(duì)比，發(fā)現(xiàn) ATP7B 缺陷小鼠的肝臟中蛋白的硫辛?；胶?Fe-S 簇蛋白的含量均有顯著降低，Hsp70 蛋白則有明顯增加。多種模型證明銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞死亡和銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是同一種機(jī)制。

圖6：銅誘導(dǎo)細(xì)胞死亡機(jī)制與銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)的遺傳模型相同

E、F：過表達(dá)SLC31A1，CuCl2 處理細(xì)胞
G、H：用 Nec-1 等處理過表達(dá) SLC31A1 的細(xì)胞，加入 CuCl2，檢測(cè)細(xì)胞活力
I、J：天然細(xì)胞內(nèi)銅伴侶谷胱甘肽的消耗導(dǎo)致銅依賴性細(xì)胞死亡，這可以在LIAS敲除后緩解
K：檢測(cè) Atpb7b-/- 小鼠與對(duì)照組肝臟的蛋白質(zhì)含量

七、總結(jié)

前面我們已經(jīng)分析過細(xì)胞凋亡、焦亡、自噬、程序性壞死以及鐵死亡等，相關(guān)信號(hào)通路解讀、文章和視頻講座等資源都匯總到了小優(yōu)的學(xué)術(shù)中心的細(xì)胞死亡大合集，有需要的戳鏈接自取呦。在此項(xiàng)研究中，作者證明了一種與現(xiàn)有已知的所有細(xì)胞死亡機(jī)制都不相同的新機(jī)制，取名為銅死亡（Cuprotosis）。

銅死亡依賴于線粒體呼吸——銅離子通過直接結(jié)合三羧酸循環(huán)途徑中的硫辛?；鞍祝瑢?dǎo)致硫辛?；鞍桩惓＞奂?，并干擾呼吸鏈復(fù)合體中的鐵硫簇蛋白，引起蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在此過程中，F(xiàn)DX1和參與蛋白質(zhì)硫辛?；牧鶄€(gè)基因是促進(jìn)銅誘導(dǎo)死亡的關(guān)鍵基因，這些基因?qū)€粒體有氧代謝至關(guān)重要。

圖7：銅死亡機(jī)制示意圖

在疾病研究方面，多種癌癥(包括乳腺癌、肺癌、胃腸道癌、口腔癌、甲狀腺癌、膽囊癌、卵巢癌和前列腺癌)患者的腫瘤或血清中，銅水平會(huì)異常升高。過量銅積累會(huì)危及生命，但可能存在一個(gè)窗口，使得細(xì)胞內(nèi)銅的更集中增加可用于選擇性殺死癌細(xì)胞。新近發(fā)現(xiàn)的銅死亡為銅與癌癥的關(guān)系提供了思路。銅離子載體Elesclomol可結(jié)合環(huán)境中存在的銅并將其帶入細(xì)胞以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。Elesclomol 可能在表達(dá)大量硫辛?；€粒體蛋白和高度呼吸的癌癥中效果好。這種方法可能對(duì)天然抵抗細(xì)胞凋亡的癌癥特別有用，通過利用這種金屬的作用，可以找到一種殺死癌細(xì)胞的新方法。

基于銅的抗癌機(jī)制，目前銅螯合劑和銅離子載體在多種腫瘤中已進(jìn)行臨床前及臨床研究。其中銅螯合劑四硫鉬酸鹽（TTM） 、ATN-224 在乳腺癌中已經(jīng)入II期臨床試驗(yàn)。銅離子載體雙硫侖（DSF）治療惡性膠質(zhì)瘤進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)，Elesclomol治療黑色素瘤也進(jìn)入了II期臨床試驗(yàn)。

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