What is Co-IP？
Co-IP全稱Co-Immunoprecipitation，中文學(xué)名免疫共沉淀，是一種以抗體和抗原識(shí)別專一性為基礎(chǔ)，用于研究蛋白質(zhì)之間相互作用的經(jīng)典方法。

通俗點(diǎn)來說，假設(shè)我們需要研究樣品中A蛋白和B蛋白之間是否存在一些相互作用，首先我們通過合適的方法處理樣本，將蛋白提取出來（同時(shí)不能破壞蛋白之間的相互作用），然后用預(yù)先結(jié)合了瓊脂糖珠或者磁珠的A蛋白抗體捕獲樣本中的A蛋白，那么與A蛋白結(jié)合的B蛋白也能一起沉淀下來。再將蛋白從珠子上裂解下來，對(duì)B蛋白進(jìn)行檢測(cè)，能檢測(cè)到，說明B蛋白在之前的沉淀過程中隨著A蛋白一起被拉下來了，進(jìn)而證明二者之間存在相互關(guān)系。
 
How to do？
實(shí)驗(yàn)流程

 
A few tips：
如何理解文獻(xiàn)中的結(jié)果？
 
各名稱解析：
IB：全稱immunoblotting，即免疫印跡，也就是常規(guī)的Western Blotting，用于顯示目的蛋白。
IP：全稱immunoprecipitation，即免疫沉淀，這一步主要是為了純化富集目的蛋白。
Input：全細(xì)胞裂解液，含有細(xì)胞內(nèi)所有的蛋白，可認(rèn)為是陽性組。也就是處理完樣本得到的細(xì)胞裂解液，在做IP實(shí)驗(yàn)之前，需要先跑WB，確認(rèn)樣本中含有蛋白A和蛋白B。
Anti-A：A蛋白的免疫共沉淀抗體
IgG：Anti-A的同型對(duì)照抗體，即跟Anti-A同來源同種型，如Anti-A是兔來源IgG型，則同型對(duì)照抗體需要選擇Rabbit IgG（abs20035）

結(jié)果圖解析：
該結(jié)果是為驗(yàn)證蛋白A與蛋白B是否存在相互作用。本實(shí)驗(yàn)一共分為兩大組：Input組及IP組，其中IP組又分為IgG組（陰性對(duì)照組）和實(shí)驗(yàn)組，并通過WB去驗(yàn)證蛋白A和B在每一個(gè)組里面是否存在。由Input組的條帶可以得到結(jié)論：蛋白A與蛋白B都是存在的，證明樣本處理提取蛋白的步驟沒有任何問題。陰性對(duì)照IgG組和實(shí)驗(yàn)組平行進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果蛋白A與蛋白B均沒有條帶，說明利用IgG抗體沒有把蛋白A和B沉淀下來，證明蛋白A和B與IgG沒有結(jié)合，排除了蛋白與抗體非特異性結(jié)合的可能性；而實(shí)驗(yàn)組蛋白A和B均有條帶，表示利用蛋白A的抗體進(jìn)行沉淀實(shí)驗(yàn)，成功把蛋白A沉淀下來了，與此同時(shí)蛋白B也被沉淀下來，進(jìn)而得到結(jié)論：蛋白A與蛋白B之間存在相互作用。

試劑盒寫著50T，意思是能做50次Co-IP實(shí)驗(yàn)？
確切來說，試劑盒的50T代表著能夠完成50次免疫沉淀反應(yīng)，而實(shí)際上免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)需要設(shè)置多個(gè)組別進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證，因此具體能夠完成多少次Co-IP實(shí)驗(yàn)由設(shè)計(jì)方案決定，一般至少需要設(shè)置陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、實(shí)驗(yàn)組三個(gè)組別。

預(yù)清除步驟的作用是什么？必須要進(jìn)行嗎？
這個(gè)步驟的目的是為去除樣本中可與protein A/G瓊脂糖珠非特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，減少干擾，非必做，如CoIP實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有較多雜帶，可考慮做一下；但應(yīng)注意，選擇此步驟后，需要消耗瓊脂糖珠，后續(xù)能夠進(jìn)行免疫沉淀的次數(shù)也相應(yīng)減少。

陰性對(duì)照IgG組出現(xiàn)條帶是什么原因？
首先需要排除lgG和后續(xù)WB一抗同源導(dǎo)致的輕重鏈的干擾條帶（25kd和50kd附近）；再者建議進(jìn)行預(yù)清除實(shí)驗(yàn)以排除Protein A/G的非特異性結(jié)合；再就是考慮lgG的問題可以換用其他品牌lgG嘗試。

出現(xiàn)假陽性結(jié)果該怎么排除？
假陽性結(jié)果需要設(shè)置對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照組一一排除，假設(shè)實(shí)驗(yàn)組為瓊脂糖珠+抗體X+靶蛋白X+抗體Y+目的蛋白Y：

最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是陰性的，是否能說明兩個(gè)蛋白之間無相互作用？
對(duì)于內(nèi)源性Co-IP實(shí)驗(yàn)，陰性結(jié)果不能說明無相互作用，也有可能是蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)過低導(dǎo)致，因此建議先做過表達(dá)Co-IP作為對(duì)照。

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