在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，包括但不限于巨噬細(xì)胞、DC（dendritic cell）、中性粒細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、CAF（tumor associated fibroblast）等多種細(xì)胞被招募到腫瘤細(xì)胞周圍的微環(huán)境中，與ECM（extracellular matrix）等元素共同構(gòu)成腫瘤免疫微環(huán)境TIME（tumor immune microenvironment）。

在TIME中的多種成分，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞以及分泌的相關(guān)因子等雖然對(duì)腫瘤起著免疫作用，但還有許多其它成分，如細(xì)胞方面包括M2型巨噬細(xì)胞、Treg細(xì)胞、Th2細(xì)胞及MDSC （Myeloid?derived suppressor cell）等發(fā)揮著免疫抑制的作用，細(xì)胞因子方面IL-4、IL-5、IL-10、TGFβ、MMP9和VEGF等等也通過(guò)特定的機(jī)制起著促進(jìn)免疫逃逸和腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。在免疫的過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞也衍生出了各種對(duì)抗免疫的機(jī)制，例減少抗原的表達(dá)，抑制DC細(xì)胞的抗原遞呈能力，抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞的浸潤(rùn)等等。

在過(guò)去的十年里，雖然關(guān)于TIME的研究文章呈逐年遞增的狀態(tài)，TIME方向作為國(guó)自然研究的熱點(diǎn)，提供了大量的基金支持，但鑒于TIME的復(fù)雜性以及癌癥治療的困難性、高復(fù)發(fā)率，對(duì)TIME的研究仍任重道遠(yuǎn)。在這里，小優(yōu)博士又整理了兩篇近期發(fā)表的關(guān)于TIME的高分文章，分別從研究背景、主要研究結(jié)果方面分享給大家，并對(duì)相關(guān)的研究思路做了部分總結(jié)，希望對(duì)大家的科學(xué)研究起到幫助作用。

一、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞在復(fù)發(fā)性骨肉瘤腫瘤免疫微環(huán)境中的調(diào)節(jié)作用

研究背景：
骨肉瘤是最常見的骨腫瘤之一，主要發(fā)生在青少年。盡管在手術(shù)和化療方面取得了很大的成就，但骨肉瘤患者的預(yù)后仍不理想。復(fù)發(fā)性骨肉瘤是臨床的一大挑戰(zhàn)，復(fù)發(fā)性骨肉瘤患者預(yù)后較差。因此，迫切需要深入探討骨肉瘤的進(jìn)展機(jī)制，加強(qiáng)對(duì)復(fù)發(fā)性骨肉瘤的認(rèn)識(shí)。

腫瘤微環(huán)境(Tumor microenvironment, TME)主要由多種細(xì)胞類型和細(xì)胞外基質(zhì)組成，與癌細(xì)胞相互作用，促進(jìn)癌癥進(jìn)展。癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)是TME中最常見的細(xì)胞，可通過(guò)癌癥干細(xì)胞更新、免疫治療療效減弱和化療耐藥性導(dǎo)致癌癥進(jìn)展。然而，CAFs免疫抑制特征在OS中的作用和機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)是一種強(qiáng)大的新工具，可以檢測(cè)遺傳和功能異質(zhì)性，重建細(xì)胞成分及其相互作用，并檢測(cè)罕見的TME亞群。ScRNA-seq用于識(shí)別和分析OS的精確細(xì)胞簇和組成。然而，這些研究都集中在細(xì)胞成分上，并沒(méi)有明確闡明TME在OS進(jìn)展中的作用和機(jī)制。

本研究在前期研究GSE152048和GSE162454的基礎(chǔ)上，利用scRNA-seq和生物信息學(xué)技術(shù)揭示CAFs在復(fù)發(fā)性O(shè)S TME中的調(diào)控作用。這可能在單細(xì)胞水平上促進(jìn)對(duì)CAFs在復(fù)發(fā)性骨肉瘤TME中的作用和機(jī)制的理解，為骨肉瘤的治療提供新的靶點(diǎn)。

首先，為了便于大家理解本文的研究思路，作者精心制作了一個(gè)研究流程圖，如下：根據(jù)GSE152048 (BC)和GSE162454 (OS)的數(shù)據(jù)集，作者進(jìn)行了scRNA-seq分析，以研究原發(fā)性、復(fù)發(fā)性和肺轉(zhuǎn)移性骨肉瘤病變的細(xì)胞構(gòu)成。GSE152048 (BC)包括來(lái)自7個(gè)原發(fā)、2個(gè)復(fù)發(fā)和2個(gè)肺轉(zhuǎn)移性O(shè)S病變的100987個(gè)細(xì)胞。GSE162454 (OS)包括29278個(gè)細(xì)胞，這些細(xì)胞來(lái)自6個(gè)原發(fā)性O(shè)S患者在接受新輔助化療之前。此外，作者又使用三個(gè)配對(duì)的原發(fā)性和復(fù)發(fā)性O(shè)S樣本，通過(guò)免疫熒光、預(yù)后分析等方法來(lái)驗(yàn)證scRNA-seq的結(jié)果。

文章研究路線圖

主要結(jié)果部分：
1 復(fù)發(fā)性O(shè)S中，CAFs的浸潤(rùn)水平較高
經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性、復(fù)發(fā)性和肺轉(zhuǎn)移性O(shè)S病灶中鑒定出14種細(xì)胞類型（A），且三種OS病灶的t-SNE圖疊加，發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性O(shè)S病變的Div-CAFs（diverse CAF）較突出(B)。雖然細(xì)胞種類在三種類型的OS病灶中沒(méi)有大的差異，但部分比例變化非常大，尤其是腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞CAF，原發(fā)性與復(fù)發(fā)性的比例為3.58%和96.42% (C)，說(shuō)明了復(fù)發(fā)性O(shè)S中，CAFs的浸潤(rùn)水平比較高。

2 在復(fù)發(fā)性O(shè)S患者組織中，CAFs與EMT相關(guān)
對(duì)原發(fā)性和復(fù)發(fā)性O(shè)S病灶中對(duì)差異表達(dá)的HALLMARK基因進(jìn)行通路富集分析，發(fā)現(xiàn)EMT（上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化）通路相關(guān)基因在復(fù)發(fā)性O(shè)S組織中明顯激活。

3 遺傳學(xué)方面證明CAFs在復(fù)發(fā)性O(shè)S中具有較高的浸潤(rùn)性
（a）    WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與OS細(xì)胞相比，CAFs具有較高的N-cadherin ( EMT 的marker )表達(dá)和較低的E-cadherin表達(dá)。同樣在復(fù)發(fā)性O(shè)S中，由于CAFs的浸潤(rùn)較多，N-cadherin表達(dá)也較高(A)。
（b）    CAFs激活marker：(a-SMA：recombinant stromal cell derived factor 1，F(xiàn)AP: fibroblast activation protein) a-SMA和FAP在復(fù)發(fā)性O(shè)S組織中顯著升高(B)。
（c）    通過(guò)TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析，F(xiàn)AP與EMT 的marker E-cadherin顯著負(fù)相關(guān)，而與N-cadherin顯著正相關(guān)(C)。
（d）    IF實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充表明復(fù)發(fā)性O(shè)S組織中的a-SMA表達(dá)高于原發(fā)骨肉瘤組織，E-cadherin表達(dá)較低(D)。

4 CAFs表達(dá)的LOX的表達(dá)模式及臨床意義
LOX: lysyl oxidase,賴氨酸氧化酶，是細(xì)胞外基質(zhì)中分泌的一種酶，底物是膠原蛋白和彈性蛋白（骨和肺的主要成分），這也是為什么骨肉瘤容易向肺部轉(zhuǎn)移的一個(gè)主要原因。

通過(guò)對(duì)CAFs和Div-CAFs細(xì)胞中差異表達(dá)的基因數(shù)據(jù)分析(A, B)及IHC實(shí)驗(yàn)(C, D)驗(yàn)證表明LOX在復(fù)發(fā)性O(shè)S組織中較原發(fā)性高，預(yù)后分析也表明LOX的高表達(dá)導(dǎo)致明顯的預(yù)后較差(E)。

5 在體外LOX 促進(jìn)復(fù)發(fā)性O(shè)S
接下來(lái)，作者用LOX的抑制劑BAPN (3-Aminopropionitrile是一種特異性的不可逆LOX抑制劑，作用于LOX或LOXL同工酶的活性位點(diǎn))進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)：CAF細(xì)胞降低，OS及TAM細(xì)胞無(wú)明顯變化（A）；CAF的基質(zhì)激活marker a-SMA和FAP表達(dá)量降低（B）；N-cadherin ( EMT 通路的marker )表達(dá)降低（C, D）；OS 細(xì)胞的遷移率及傷口愈合速率均明顯降低篇（E）；另外檢測(cè)到起促進(jìn)免疫反應(yīng)的M1類型的巨噬細(xì)胞（INOS）明顯升高而抑制免疫反應(yīng)的M2型巨噬細(xì)胞（CD163）降低（F）。

6 在體內(nèi)，LOX抑制產(chǎn)生抗OS作用
接下來(lái)在體內(nèi)驗(yàn)證LOX的作用，對(duì)腫瘤進(jìn)行異種移植，經(jīng)BAPN處理后，檢測(cè)到腫瘤體積降低， LOX表達(dá)水平降低（A，B）；CAF的基質(zhì)激活marker a-SMA和FAP表達(dá)量也降低（C）；同樣的與體外檢測(cè)結(jié)果一致，M1類型的巨噬細(xì)胞明顯升高而M2型巨噬細(xì)胞降低（D）；最后，CD8細(xì)胞有所升高但不明顯（E）。

最后，作者制作了一張示意圖，對(duì)本文的研究做出總結(jié)。即在復(fù)發(fā)性骨肉瘤中，CAFs浸潤(rùn)水平較高，在復(fù)發(fā)性O(shè)S的細(xì)胞類型中，LOX在CAFs中表達(dá)量最高，BAPN抑制LOX可調(diào)節(jié)CAFs功能，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向促進(jìn)免疫的M1類型極化，進(jìn)而抑制OS。

二、MUC1-C在三陰性乳腺癌中整合IFN-γ通路的激活和腫瘤免疫微環(huán)境的抑制

Doi:10.1136/jitc-2020-002115

研究背景：
三陰性乳腺癌(TNBC)是一種侵襲性疾病，治療選擇有限。TNBC患者通常采用新輔助或輔助化療。TNBC患者對(duì)化療反應(yīng)的生存期改善與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TILs)的存在有關(guān)。因此，腫瘤免疫微環(huán)境(TIME)中TILs (特別是CD8+ T細(xì)胞)的增加可以預(yù)測(cè)早期TNBC患者對(duì)治療的反應(yīng)和預(yù)后的改善。

MUC1-C是一種在TNBC細(xì)胞中異常表達(dá)的致癌蛋白。MUC1-C通過(guò)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、表觀遺傳重編程、干性、自我更新能力來(lái)驅(qū)動(dòng)TNBC細(xì)胞進(jìn)展中的譜系可塑性。EMT和癌癥干細(xì)胞狀態(tài)與免疫逃避有關(guān)，盡管機(jī)制尚不清楚。

本文對(duì)大量和單個(gè)TNBC細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)集的分析進(jìn)一步表明，MUC1與JAK1、STAT1、IRF1、IDO1和PTGES的內(nèi)在表達(dá)有關(guān)。在TNBC的腫瘤免疫微環(huán)境中，MUC1與CD8+ T細(xì)胞的衰竭和功能障礙有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)為MUC1-C在TNBC中整合譜系可塑性和免疫抑制提供了新的見解。

主要結(jié)果部分：
1 MUC1-C激活I(lǐng)FN-γ→JAK1→STAT1信號(hào)通路富集的整個(gè)轉(zhuǎn)錄程序
對(duì)BT-549 TNBC細(xì)胞的整體轉(zhuǎn)錄譜分析表明，誘導(dǎo)MUC1-C沉默可導(dǎo)致基因表達(dá)的廣泛變化，約有2300個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)生了下調(diào)，1100多個(gè)基因的表達(dá)有所上調(diào)（A）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)沉默MUC1-C會(huì)導(dǎo)致(1)STAT1和IRF1（B）以及(2) IFN通路反應(yīng)基因的下調(diào)（C），與MUC1-C誘導(dǎo)的表達(dá)模式相關(guān)的主要調(diào)控因子包括STAT1和IRF1，證實(shí)MUC1-C通過(guò)STAT-IRF轉(zhuǎn)錄因子活性介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)(D)。Motif評(píng)估進(jìn)一步驗(yàn)證了MUC1-C誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因在STAT和IRF Motif中高度富集(E)?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明STAT-IRF因子是MUC1-C誘導(dǎo)的TNBC細(xì)胞轉(zhuǎn)錄應(yīng)答的主要驅(qū)動(dòng)因素。

2 在TNBC細(xì)胞中MUC1-C激活JAK1→STAT1→IRF1信號(hào)
接下來(lái)，在BT-549和SUM149細(xì)胞中降低MUC1-C基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)STAT1和IRF1基因在mRNA及蛋白水平的表達(dá)均有所降低（A-C）。通過(guò)對(duì)MUC1-C基因的蛋白序列分析，發(fā)現(xiàn)MUC1-C包含分別結(jié)合JAK1和IRF1的兩個(gè)motif，JAK1作為激酶，當(dāng)MUC1-C結(jié)合兩種蛋白時(shí)，便會(huì)對(duì)STAT1進(jìn)行磷酸化，因此在前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，由于MUC1-C基因的下調(diào)，磷酸化的pSTAT1蛋白也降低（A-C）。接下來(lái)，通過(guò)用MUC1-C的抑制劑GO-203抑制MUC1-C的表達(dá)，同樣檢測(cè)到了JAK1，STAT1，pSTAT1, 及IRF1蛋白表達(dá)的下調(diào)，再次驗(yàn)證了之前的結(jié)果。

3 下調(diào)MUC1-C 抑制IRF1下游基因 IDO1 和 COX2/PTGES
MUC1-C下調(diào)后，作者又對(duì)下游基因IDO1在BT-549及COX2/PTGES的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。檢測(cè)到在BT-549、SUM149細(xì)胞中及抑制劑GO-203處理后，IDO1表達(dá)水平均降低（B-D）。 此外，作者發(fā)現(xiàn)MUC1-C驅(qū)動(dòng)COX2/PTGS2和PTGES (E)的表達(dá)，它們共同合成PGE2 (一種與TNBC腫瘤生存率降低相關(guān)的T-cell功能抑制劑)。為了支持這些結(jié)果，對(duì)MDA-MB-468 TNBC細(xì)胞的研究證實(shí)MUC1-C驅(qū)動(dòng)COX2和PTGES的表達(dá)(F-G)。

4 MUC1 與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的減少有關(guān)
接下來(lái)，為了檢測(cè)MUC1-C對(duì)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的影響，作者對(duì)兩種RNA-seq數(shù)據(jù)TCGA-BRCA cohort（A）及METABRIC cohort (B)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，相對(duì)于MUC1-C表達(dá)低的腫瘤，MUC1-C表達(dá)高的腫瘤中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，特別是CD8 + T細(xì)胞、CD8 + naive T細(xì)胞、B細(xì)胞和Th2細(xì)胞等（C, D）。在MUC1-C表達(dá)低和MUC1-C表達(dá)高的情況下，細(xì)胞類型富集的總體模式在TCGA-BRCA和METABRIC隊(duì)列中顯著相關(guān)（E, F）。此外，在兩個(gè)數(shù)據(jù)中，基于所有免疫細(xì)胞類型估計(jì)的總免疫活性的定量在MUC1-C表達(dá)高的情況下顯著降低（G）。

5 MUC1-C在TNBC腫瘤中的表達(dá)與IFN-γ通路的激活和CD8+ T細(xì)胞的衰竭和功能紊亂有關(guān)
結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果及通過(guò)對(duì)TNBC腫瘤中TCGA-BRCA和METABRIC數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)MUC1與IFN-γ通路的激活有關(guān)（A, B）；MUC1-C的表達(dá)與CD8+ naive T細(xì)胞的耗竭顯著相關(guān)（C, D）；IFN-γ通路在t細(xì)胞功能紊亂的TNBCs中高度富集（E, F）；此外還發(fā)現(xiàn)MUC1-C在兩種TNBC數(shù)據(jù)集中都與T-cell功能障礙顯著相關(guān)，這表明MUC1-C誘導(dǎo)的IFN-γ通路激活導(dǎo)致CD8+ T細(xì)胞排斥和功能障礙。
最后，對(duì)本文的研究做出總結(jié)，MUC1-C通過(guò)誘導(dǎo)IDO1和COX2激活I(lǐng)FN-γ→STAT1→IRF1通路（I），這為MUC1-C在TNBC的腫瘤免疫微環(huán)境中驅(qū)動(dòng)CD8+ T細(xì)胞排斥和/或功能紊亂的潛在重要性提供了支持。

總結(jié)，在看了一些關(guān)于腫瘤免疫微環(huán)境相關(guān)的文章后，對(duì)于一些研究思路，小尤博士做了一些總結(jié)，并形成了一個(gè)流程圖，當(dāng)然不能代表所有相關(guān)的思路，希望為各位小伙伴的研究帶來(lái)一些參考作用。

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