使用細(xì)胞器選擇性染色劑或染料讓細(xì)胞器顯色是細(xì)胞和組織熒光成像的關(guān)鍵。這些特異性染色劑適合用作抗體復(fù)染劑，幫助識(shí)別細(xì)胞內(nèi)特定位置的目標(biāo)靶點(diǎn)。除了固定細(xì)胞的研究外，對(duì)活細(xì)胞的研究可以更好的了解細(xì)胞內(nèi)生命活動(dòng)的狀態(tài)及其變化，其難點(diǎn)在于活細(xì)胞細(xì)胞膜的選擇透過(guò)性，會(huì)阻止外界物質(zhì)的進(jìn)出，因此選擇合適的熒光染料至關(guān)重要。

本文主要針對(duì)以下幾個(gè)常見(jiàn)的亞細(xì)胞架構(gòu)：細(xì)胞骨架、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、細(xì)胞核、溶酶體、細(xì)胞膜，為大家介紹如何在活細(xì)胞或固定細(xì)胞中選擇合適的試劑/探針?lè)謩e對(duì)它們進(jìn)行染色。

一、細(xì)胞骨架

1.1 肌動(dòng)蛋白

1.1（a）活細(xì)胞肌動(dòng)蛋白染色：

對(duì)于活細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白染色，可以通過(guò)帶有熒光染料的肌動(dòng)蛋白，或帶有GFP標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白來(lái)進(jìn)行染色。雖然熒光肌動(dòng)蛋白能夠最準(zhǔn)確的定位出靶點(diǎn)肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)，但對(duì)于某些細(xì)胞（如原代細(xì)胞），通過(guò)顯微注射或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑的手段，較難實(shí)現(xiàn)將熒光肌動(dòng)蛋白引入目標(biāo)細(xì)胞中。此時(shí)好的方式是使用低細(xì)胞毒性、高特異性、可通過(guò)活細(xì)胞的細(xì)胞呈象探針（SIR-actin™）

《Natural Method》中，就描述了如何利用這種探針來(lái)進(jìn)行細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的活細(xì)胞呈象，如圖2所示。同時(shí)，其中還就染色探針在長(zhǎng)期成像濃度下對(duì)細(xì)胞的毒性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明在24小時(shí)內(nèi)，SiR -tubulin和SiR -actin對(duì)原代人成纖維細(xì)胞都沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。

圖1. 結(jié)構(gòu)化照明顯微鏡(Structured illumination microscopy，SIM)下，使用SIR -tubulin(左)或SIR -actin(右)染色的人成纖維細(xì)胞。

圖2. 對(duì)SiR-tubulin（上）和SiR-actin（下）熒光染色探針毒性測(cè)試結(jié)果。白色亮點(diǎn)代表代表沒(méi)辦法繼續(xù)進(jìn)行有絲分裂或由于細(xì)胞骨架的改變無(wú)法在表面繼續(xù)生長(zhǎng)的細(xì)胞。

1.1（b）固定細(xì)胞肌動(dòng)蛋白染色：

最常見(jiàn)的固定細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白染色劑是鬼筆環(huán)肽偶聯(lián)物（phalloidins）。帶正電或負(fù)電的熒光染料會(huì)通過(guò)非特異性的離子相互作用與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致產(chǎn)生更高的背景；Actin-stain系列的鬼筆環(huán)肽熒光探針是非離子型的，因此更有助于獲得理想的低背景結(jié)果。

圖3. 在Swiss3TS細(xì)胞中，使用 anti-vinculin（紅色）進(jìn)行，Dapi進(jìn)行核染(藍(lán)色)，用Actin -stain™488 Phalloidin (# PHDG1, Cytoskeleton對(duì)F-actin進(jìn)行染色(綠色)

下表對(duì)幾種鬼筆環(huán)肽熒光染料的生物特性（染色亮度、光漂白穩(wěn)定性、背景強(qiáng)度、親和力等）進(jìn)行了對(duì)比：

*= AFU's measured by quantitative cell imaging.

**=Measured in stained Swiss 3T3 cells in the absence of antifade.

若實(shí)驗(yàn)中使用到甲醛進(jìn)行固定或透化，甲醛會(huì)破壞鬼筆環(huán)肽的天然結(jié)構(gòu)，因此可以考慮使用免疫熒光法對(duì)固定細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白進(jìn)行染色。如今被發(fā)現(xiàn)的肌動(dòng)蛋白亞型總共有6種，包括α-actin （ACTA1）、平滑肌α-actin（ACTA2）、細(xì)胞質(zhì)β-actin（ACTB）、心肌α-actin（ACTC1）、細(xì)胞質(zhì)γ-actin（ACTG1）、平滑肌γ-actin（ACTG2/ACTA3）。針對(duì)不同亞型的肌動(dòng)蛋白，可以選擇不同的特異性一抗，如下表所示：

若使用沒(méi)有標(biāo)記的一抗試劑，則需要選擇合適的二抗試劑來(lái)進(jìn)行后續(xù)的顯色，二抗的選擇指南可以參考這篇文章：二抗選擇超全攻略，一秒收藏！。

1.2 微管蛋白

微管蛋白（Tubulin）的染色和肌動(dòng)蛋白類(lèi)似，固定細(xì)胞中可以使用鬼筆環(huán)肽和免疫熒光法（相關(guān)特異性抗體如下表所示）；活細(xì)胞中則可以使用特殊的熒光探針進(jìn)行顯色。

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二、細(xì)胞核

對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色主要是利用能與DNA相結(jié)合的染料或探針，活細(xì)胞的細(xì)胞核熒光探針，如SiR™、SPY™、Hoechst™等；固定細(xì)胞的細(xì)胞核染料：DAPI和溴化乙錠（EB）。

2.1 活細(xì)胞中細(xì)胞核的染色

圖4. 使用SPY™505-DNA（綠色）和SPY555-actin（洋紅色）對(duì)Hela活細(xì)胞進(jìn)行復(fù)染。

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2.2 固定細(xì)胞中細(xì)胞核的染色

固定細(xì)胞還可以使用免疫熒光法對(duì)細(xì)胞和進(jìn)行染色定位，此時(shí)可以精確的定位到核膜和核仁，如圖5(綠色熒光)所示：

圖5. 免疫熒光法分別對(duì)核膜(A) / 細(xì)胞核(B) /核仁 (C) / 細(xì)胞核(剔除核仁) (D)進(jìn)行染色（綠色熒光）。

圖5中使用的相關(guān)抗體：

三、線粒體

線粒體是細(xì)胞中重要的功能器官，使用特定的熒光染料或探針對(duì)其進(jìn)行染色，可作為細(xì)胞是否健康的重要指標(biāo)之一。染料在線粒體上的積累和定位取決于線粒體膜電位，在有線粒體膜電位的健康細(xì)胞中，會(huì)顯示明亮的熒光信號(hào)，而在失去線粒體膜電位的細(xì)胞中，則熒光信號(hào)弱。

3.1 活細(xì)胞中線粒體染色

為了在活細(xì)胞中對(duì)線粒體標(biāo)記，也需要借助專(zhuān)門(mén)的熒光探針試劑。細(xì)胞將在一定濃度的特定探針中培養(yǎng)，接著探針通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散穿過(guò)細(xì)胞膜并在活性線粒體中積累。一旦線粒體被探針標(biāo)記，細(xì)胞就可以用醛基固定劑進(jìn)行處理，以便對(duì)樣本進(jìn)一步處理。因?yàn)镸itoTracker® Red CMXRos和MitoTracker® Deep Red FM探針產(chǎn)生的熒光波長(zhǎng)更長(zhǎng)，因此適用于多重染色標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中。

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3.2 固定細(xì)胞中線粒體染色

在固定細(xì)胞中，有許多可用的線粒體標(biāo)志物，常見(jiàn)的線粒體標(biāo)志物如表1所示

表1. 常見(jiàn)的線粒體標(biāo)志物。

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四、溶酶體

溶酶體是動(dòng)物細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，內(nèi)部含有豐富的水解酶，其結(jié)構(gòu)的完整性與生命體的生理病理均有著密切的關(guān)系。

4.1 活細(xì)胞溶酶體染色

常見(jiàn)的針對(duì)活細(xì)胞中溶酶體的熒光探針包括LysoTracker™系列，由于其對(duì)酸性細(xì)胞器有高度選擇性（溶酶體內(nèi)部pH約3.5~5），因此可以對(duì)溶酶體進(jìn)行特異性染色。

相比LysoTracker™，LysoBrite™的探針在長(zhǎng)時(shí)間追蹤活細(xì)胞中的溶酶體上，具有更明顯的優(yōu)勢(shì)。LysoBrite™染料可以在活細(xì)胞中停留超過(guò)一周，細(xì)胞毒性極小，而LysoTracker染料只能使用幾個(gè)小時(shí)。且LysoBrite™染料比LysoTracker染料更具有光穩(wěn)定性，如圖6所示。

圖6.A: LysoBrite™ Red染色, B: LysoTracker™ Red (來(lái)自Invitrogen)進(jìn)行染色的Hela細(xì)胞圖像。用Olympus熒光顯微鏡對(duì)0秒和120秒曝光時(shí)間下的信號(hào)進(jìn)行比較

表2. LysoBrite™系列探針的激發(fā)/吸收波長(zhǎng)對(duì)比表

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五、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和高爾基體主要負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的分類(lèi)，因此，針對(duì)這兩個(gè)細(xì)胞器的大部分染色探針都是脂質(zhì)或是可以影響蛋白質(zhì)運(yùn)動(dòng)的化學(xué)物質(zhì)。在活細(xì)胞和固定細(xì)胞中，ER和高爾基體的扁平膜囊可以用各種親脂探針進(jìn)行染色，然后根據(jù)其形態(tài)進(jìn)行區(qū)分。

5.1 活細(xì)胞中ER和高爾基體的染色

ER-Tracker™ 系列的染色探針針對(duì)的是活細(xì)胞，對(duì)ER具有高度選擇性。這些染料很少染色線粒體，不像傳統(tǒng)的ER染色劑DiOC6(3) (D273)，ER-Tracker™ 探針的對(duì)細(xì)胞毒性很小。當(dāng)使用特定優(yōu)化方案對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)，即使經(jīng)過(guò)甲醛的處理，染色模式仍然保留。

還有一類(lèi)熒光鞘脂衍生物（sphingosine derivative），如NBD C6-ceramide、BDP FL-ceramide等，也是ER/高爾基體在活細(xì)胞中的重要染色探針之一。

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六、細(xì)胞膜

細(xì)胞脂膜是動(dòng)態(tài)的、流體結(jié)構(gòu)(約4納米厚)，這是生物學(xué)上的必要條件，因?yàn)槿粢?xì)胞參與基本的細(xì)胞和亞細(xì)胞生理功能（如遷移、細(xì)胞擴(kuò)散、吞噬、細(xì)胞分裂、內(nèi)吞、機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝等），則需要這些細(xì)胞膜/基質(zhì)膜能夠改變形狀和張力。

6.1 活細(xì)胞中細(xì)胞膜染色

對(duì)細(xì)胞膜張力的研究在細(xì)胞生理學(xué)中很重要。熒光膜張力探針Flipper-TR®(Spirochrome, Ltd.)可以對(duì)活細(xì)胞中的膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行特異性染色，以對(duì)膜的張力進(jìn)行研究。如圖6所示，對(duì)經(jīng)歷了高滲透沖擊的細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化分析。

圖7. 使用Flipper-TR®探針對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。在高滲透沖擊前(上)和沖擊后(下)染色的Flipper-TR®圖像?；叶缺硎緹晒鈴?qiáng)度，彩色編碼表示熒光壽命。右邊的直方圖顯示了滲透沖擊后的壽命變化。

除此之外Flipper-TR®探針還提供針對(duì)其他細(xì)胞器膜/基質(zhì)膜（Plasma membrane）的染色，如溶酶體膜、線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。

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