隨著2015年精準醫(yī)療計劃的提出，液體活檢技術備受關注。液體活檢常見的三種有效素材主要有：游離DNA(circulating cell-free DNA, cfDNA)、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）、外泌體。

圖1 液體活檢方案。人體血液中含有細胞、胞外膜囊泡(EMVS)、游離DNA (cfDNA)、游離RNA (cfRNA)和蛋白質，可作為各種疾病的生物標志物

一、什么是游離DNA?

游離DNA又稱循環(huán)DNA、無細胞DNA，是指存在于血漿、血清或尿液等體液中的細胞外DNA。循環(huán)腫瘤DNA是指壞死或凋亡的腫瘤細胞釋放到外周血中的腫瘤DNA片段，是腫瘤患者cfDNA的一種。最早在1948年，Mandel次在人類血液中檢測到存在cfDNA,但當時并沒有引起科學界的關注。直到1977年,Leon等報道了腫瘤患者外周血中存在較高水平的cfDNA，隨后眾多學者開始了腫瘤患者外周血中cfDNA研究。1997年,香港的盧煜明教授運用PCR技術在孕婦的血漿中擴增了Y染色體特異性片段,證明懷有男胎的孕婦血漿中存在胎兒cfDNA,從而為無創(chuàng)產前篩查奠定了基礎。

關于cfDNA的產生來源，目前普遍認為細胞主動釋放、細胞發(fā)生凋亡、細胞壞死釋放的DNA片段是cfDNA的主要來源。一般來說，癌癥患者的正常循環(huán)cfDNA水平比健康人高得多。因為隨著腫瘤體積的增大，細胞的更新也隨之增加，凋亡和壞死細胞的數量也隨之增加。在正常的生理情況下，凋亡和壞死的殘留物可通過浸潤的吞噬細胞清除。但這不能有效地發(fā)生在腫瘤腫塊內，導致細胞碎片的積累不可避免地釋放到循環(huán)中使cfDNA濃度顯著升高。

圖2 游離DNA的主要來源

cfDNA大部分為雙鏈DNA分子，其片段分布與核小體的結構有關，每個核小體單位包括一個組蛋白八聚體、DNA分子及一分子H1；組蛋白八聚體構成核小體的盤狀核心結構，146bp的DNA分子超螺旋盤繞組蛋白八聚體1.75圈，組蛋白H1在核心顆粒外結合額外20bp DNA，鎖住核小體DNA的進出端，起到穩(wěn)定核小體的作用。因此cfDNA長度主要集中在80-300bp,峰值位于166bp左右，且存在10.4bp的波動。cfDNA在健康個體中通常濃度很低，血漿cfDNA被認為主要來自造血系正常細胞的凋亡，其他組織的貢獻很小。并且cfDNA的半衰期很短，僅1-2小時，不穩(wěn)定易降解。

相比于組織而言，檢測cfDNA具有三大優(yōu)勢1.可及性：cfDNA容易獲取，且可以反復取樣；2.全面性：可全面反映腫瘤組織的異質性；3.實時性：可實時動態(tài)監(jiān)測疾病的狀態(tài)（如耐藥方面），因此cfDNA檢測逐漸成為體外診斷應用方面的寵兒。

圖3 cfDNA的結構

圖4 常規(guī)測序文庫制備測定cfDNA的片段長度

二、游離DNA應用實例

圖5 cfDNA的應用

1.無創(chuàng)產前篩查（NIPT）

基于1997年盧煜明教授及其團隊發(fā)現孕婦的血漿內存有高濃度的胎兒DNA，他們研發(fā)推出了唐氏綜合征的無創(chuàng)檢驗方法—NIPT（noninvasive prenatal testing），迅速被超過90個國家所采用。NIPT即無創(chuàng)性胎兒染色體非整倍體檢測，也稱無創(chuàng)產前DNA檢測,在臨床上主要用于唐氏綜合征的篩查。通過采集孕媽媽外周血，從中提取游離DNA（包含媽媽和寶寶DNA），來分析寶寶的染色體情況。但以目前的醫(yī)療水平還不能治愈唐氏綜合征，所以加強孕期產檢，減少唐氏綜合征患兒的出生十分重要。

圖6 NIPT檢驗流程

2.腫瘤相關分析

無需有創(chuàng)腫瘤活檢，而是直接從常規(guī)抽血中分析來自腫瘤的DNA，cfDNA分析在癌癥發(fā)展、診斷和治療的整個自然過程中具有多種潛在應用。Web of science引文報告顯示：2017年與2018年間與cfDNA研究有關的文章，51%聚焦于腫瘤方面，由此可見cfDNA在腫瘤方向的應用火熱。2016年6月1日，FDA批準首ge適用于血液cfDNA檢測的、用于檢測非小細胞肺癌(NSCLC)患者表皮生長因子受體(EGFR)基因突變的基因檢測試劑盒，這是作為cfDNA首cii應用于腫瘤伴隨診斷、藥物療效監(jiān)測的批準。同時Nitzan等于nature reviews cancer雜志上發(fā)表名為“Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA"的文章表明ctDNA可用于耐藥突變及新發(fā)突變分析。

圖7 ctDNA可用于耐藥突變及新發(fā)突變分析應用

2020年發(fā)表于Nature雜志上的一篇文章，研究者對早期的肺癌患者治療前血漿中ctDNA的含量進行檢測研究，發(fā)現在一定時間內（監(jiān)測100個月）肺癌患者治療前ctDNA高的病人復發(fā)率以及遠處轉移率均高于ctDNA含量低的病人，因此ctDNA對于腫瘤的監(jiān)測及預后方面具有一定積極意義。

圖8 cfDNA在腫瘤動態(tài)監(jiān)測、預后方面的應用

Jay Shendure等于Cell雜志上發(fā)表的文章利用癌癥患者的ctDNA樣本進行測序，發(fā)現不同的癌癥類型可以ctDNA上產生不同的核小體的指紋。因此對于某些癌癥患者而言，研究者可以利用ctDNA鑒別腫瘤的組織學來源。

圖9 ctDNA可以用于分析腫瘤組織來源（在癌癥溯源方面應用）

由復旦大學金力院士牽頭的癌癥早篩研究結果于2020年發(fā)表于Nature Communication雜志，該研究采用PanSeer癌癥早篩技術，通過檢測cfDNA甲基化狀態(tài)實現多癌種篩查，可提前4年發(fā)現癌癥患者血液中的甲基化信號，實現癌癥早篩的功能。

圖10 cfDNA在癌癥早篩中的應用

3.微生物感染診斷

與傳統(tǒng)微生物檢測相比，微生物游離DNA(mcfDNA)檢測陽性率更高，mcfDNA目前已在臨床感染的診治中發(fā)揮了重要作用，如膿毒癥、社區(qū)獲得性肺炎、結核病、侵襲性真菌病、尿路感染、器guan移植后感染等。Blauwkamp等于Nature Microbiology上發(fā)表的血漿mcfDNA高通量測序研究中表明：臨床納入348例疑似膿毒癥患者，與首ci陽性的血培養(yǎng)相比，其陽性符合率為93.7%。在出現癥狀前出現抗菌藥物的患者中，NGS檢出可靠或者確定的病原比例為47.9%，血培養(yǎng)靈敏度為19.6%，由此可見mcf檢測微生物感染的優(yōu)勢。

圖11 微生物游離DNA在感染診斷中的應用

三、本期產品推薦

參考文獻

【1】Szilágyi M, P?s O, Márton é, et al. Circulating Cell-Free Nucleic Acids: Main Characteristics and Clinical Application. Int J Mol Sci. 2020;21(18):6827. Published 2020 Sep 17. doi:10.3390/ijms21186827

【2】Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF, et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet. 1997;350(9076):485-487. doi:10.1016/S0140-6736(97)02174-0

【3】Snyder MW, Kircher M, Hill AJ, Daza RM, Shendure J. Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin. Cell. 2016;164(1-2):57-68. doi:10.1016/j.cell.2015.11.050

【4】Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, et al. Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA. Nat Rev Cancer. 2017;17(4):223-238. doi:10.1038/nrc.2017.7

【5】Chabon JJ, Hamilton EG, Kurtz DM, et al. Integrating genomic features for non-invasive early lung cancer detection. Nature. 2020;580(7802):245-251. doi:10.1038/s41586-020-2140-0

【6】Chen X, Gole J, Gore A, et al. Non-invasive early detection of cancer four years before conventional diagnosis using a blood test. Nat Commun. 2020;11(1):3475. Published 2020 Jul 21. doi:10.1038/s41467-020-17316-z

【7】Blauwkamp TA, Thair S, Rosen MJ, et al. Analytical and clinical validation of a microbial cell-free DNA sequencing test for infectious disease. Nat Microbiol. 2019;4(4):663-674. doi:10.1038/s41564-018-0349-6