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免疫分析——MSD電化學(xué)發(fā)光技術(shù)

閱讀：1573 發(fā)布時(shí)間：2023-8-11

一、概念

電化學(xué)發(fā)光 (Electrochemiluminescence ) 是繼放射免疫、酶免疫、熒光免疫、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定以后的新一代標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)。電化學(xué)發(fā)光法是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，包括了電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過(guò)程。電化學(xué)發(fā)光 (Electrochemiluminescence ) 可以應(yīng)用于所有的免疫測(cè)定，電化學(xué)發(fā)光能取代第一代放射免疫的靈敏度，又繼承了第二代酶聯(lián)免疫的通量方便，因而廣泛被全球大量用戶(hù)所認(rèn)可和使用，從被載入了免疫分析技術(shù)發(fā)展的史冊(cè)。

免疫分析技術(shù)發(fā)展的三代

二、MSD電化學(xué)發(fā)光原理

MSD（Meso Scale Discovery）的電化學(xué)發(fā)光技術(shù)是基于Elisa原理的升級(jí)，在96/384微孔板（石墨材質(zhì)，背面帶有電路）的板底包被捕獲抗體，加入待測(cè)樣本，加入三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記的檢測(cè)抗體，形成雙抗體夾心復(fù)合物，將微孔板放入MSD儀器中，微孔板通電后，三聯(lián)吡啶釕發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，由[Ru(bpy) 3 ] 3+變成 [Ru(bpy) 3 ] 2+，再回到[Ru(bpy) 3 ] 3+，并且這個(gè)循環(huán)反應(yīng)可以持續(xù)進(jìn)行，在此過(guò)程中會(huì)釋放出光子（620nm檢測(cè)）被儀器中的CCD相機(jī)捕獲，釋放出的光子和待測(cè)物的濃度成正比。

三、MSD多因子檢測(cè)原理

（1）MSD通過(guò)點(diǎn)陣技術(shù)，在96/384石墨電極板里的每個(gè)孔的不同spot中預(yù)先點(diǎn)印上1-10種捕獲抗體，從而實(shí)現(xiàn)1-10個(gè)指標(biāo)/每孔的檢測(cè)。

通常MSD的V-PLEX試劑盒通過(guò)該方法實(shí)現(xiàn)多因子檢測(cè)，下面是幾款經(jīng)典熱賣(mài)的試劑盒：

K15049D V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit

K15048D V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Mouse Kit

K15059D V-PLEX Proinflammatory Panel 2 Rat Kit

K15396S S-PLEX Proinflammatory Panel 1 (human) Kit（fg/mL靈敏度）

（2）借助linker將捕獲抗體帶到一個(gè)孔中的不同區(qū)域內(nèi)，在一個(gè)孔內(nèi)實(shí)現(xiàn)多因子檢測(cè)。通常U-PLEX試劑盒就是通過(guò)該方法實(shí)現(xiàn)多因子檢測(cè)。

1. Linker與捕獲抗體連接：

U-PLEX plate每個(gè)孔內(nèi)有1-10個(gè)spot，每個(gè)spot內(nèi)有基座分別與不同linker匹配；linker有生物素結(jié)合區(qū)域，可以結(jié)合生物素化的捕獲抗體。因此捕獲抗體可以被linker帶到相應(yīng)的spot里。

例如檢測(cè)四種指標(biāo)，第一步，將四種指標(biāo)對(duì)應(yīng)的生物素化捕獲抗體與四種linker，分別在四支管子內(nèi)混合，分別完成linker與捕獲抗體的偶聯(lián)，之后加入stop solution終止反應(yīng)。

2. Linker帶著生物素化捕獲抗體到一個(gè)孔的不同區(qū)域：

將四種Linker連接的捕獲抗體混合制成混合液A。

將混合液A包被U-PLEX plate，不同的Linker就會(huì)帶著連接的捕獲抗體到相應(yīng)的spot中，完成在同一個(gè)孔內(nèi)包被多種捕獲抗體，實(shí)現(xiàn)在一個(gè)孔內(nèi)進(jìn)行多指標(biāo)檢測(cè)（最多可在一個(gè)孔中實(shí)現(xiàn)10種指標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)）

3. 后續(xù)流程同ELISA，完成實(shí)驗(yàn)

在板內(nèi)加入樣本進(jìn)行孵育結(jié)合；

準(zhǔn)備四種指標(biāo)的檢測(cè)抗體混合液（抗體帶sulfo-tag標(biāo)記），加入板內(nèi)進(jìn)行孵育結(jié)合；

加入read buffer讀板液上機(jī)讀板檢測(cè)，根據(jù)各個(gè)spot相應(yīng)位置的光信號(hào)值，定量各檢測(cè)指標(biāo)的濃度。

通常MSD的U-PLEX試劑盒通過(guò)該方法實(shí)現(xiàn)多因子檢測(cè)，可以在以下試劑盒中挑選感興趣的因子，自由組合在一塊板，實(shí)現(xiàn)多因子檢測(cè)。

K15604K

U-PLEX Immuno-Oncology Group 1 (human) 131-Plex

APRIL/TNFSF13, BAFF-R/TNFRSF13C, BCMA/TNFRSF17, CD20, CD27, CD28, CD40L (soluble), CD276/B7-H3, C-Peptide, CTACK, CTLA-4, ENA-78, Eotaxin, Eotaxin-2, Eotaxin-3, EPO, E-Selectin, FGF (basic), FGF-23, FLT3L, Fractalkine, FSH, Galectin-9, G-CSF, Ghrelin (active), GIP (active), GIP (inactive), GITR/TNFRSF18, GITRL/TNFSF18, GLP-1 (active), GLP-1 (inactive), GM-CSF, gp130 (soluble), Granzyme A, Granzyme B, GRO-α, HAVCR2/TIM-3, HVEM/TNFRSF14, I-309, ICOS, ICOS-L/B7-H2, IFN-α2a, IFN-β, IFN-γ, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-2, IL-2Rα, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12/IL-23p40, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17A, IL-17A/F, IL-17C, IL-17D, IL-17E/IL-25, IL-17F, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-29/IFN-λ1, IL-31, IL-33, Insulin, IP-10, I-TAC, LAG3, Leptin, LIGHT/TNFSF14, Luteinizing Hormone (LH), MCP-1, MCP-2, MCP-4, M-CSF, MDC, MIF, MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-5, MMP-1, MMP-2, MMP-7, MMP-9 (total), Nectin-4, OX40/TNFRSF4, PD1 (epitope 1), PD1 (epitope 2), PD-L1 (epitope 1), PD-L1 (epitope 2), PD-L2, Pentraxin 3, Perforin, PlGF, PP, Proinsulin, proMMP-9, P-Selectin, PYY (total), RAGE (soluble), RANKL/TNFSF11, RANTES, S100A12, SDF-1α, Tie-2, TIGIT, TLR1, TNF-α, TNF-β, TNF-RI, TNF-RII, TPO, TRAIL, TSLP, VEGF-A, VEGF-D, VEGFR-1/Flt-1, YKL-40

四、電化學(xué)發(fā)光特點(diǎn)

·節(jié)約樣本用量（25uL）

·高靈敏度（fg/ml）

·寬線(xiàn)性范圍（5-6log）

·多因子檢測(cè)（10因子）

·高重復(fù)性

·降低基質(zhì)效應(yīng)

MSD電化學(xué)發(fā)光儀器