一提到安定或地x泮，人們就會(huì)想到抗抑郁藥和抗焦慮藥。如果您有藥理學(xué)背景，您可能還會(huì)想到苯二氮卓（BDZs）這類(lèi)古老的藥物。但氧化應(yīng)激和腎上腺素能受體的調(diào)節(jié)又是怎么回事呢？羅馬國(guó)立衛(wèi)生研究院的一項(xiàng)新研究對(duì)地x泮等β-AR激動(dòng)劑治療期間β1-和β2-腎上腺素能受體（β1- AR和β2-AR）的調(diào)節(jié)提供了一些令人著迷的見(jiàn)解1。

在這項(xiàng)研究過(guò)程中，研究人員使用了針對(duì) β-ARs 細(xì)胞外表位的特異性抗體和流式細(xì)胞術(shù)來(lái)評(píng)估單核細(xì)胞中這些受體的細(xì)胞表面調(diào)控。他們發(fā)現(xiàn)地x泮會(huì)刺激氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)劑，進(jìn)而影響細(xì)胞表面的 β1-AR 密度。此外，他們還發(fā)現(xiàn)這些受體不易受激動(dòng)劑介導(dǎo)的下調(diào)影響。

什么是β-腎上腺素能受體？

β-腎上腺素能受體屬于 G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）超家族，通過(guò)激活腺苷酸環(huán)化酶對(duì)兒茶酚胺做出反應(yīng)。GPCR 具有復(fù)雜的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制，如下調(diào)細(xì)胞表面受體密度2。

β-ARs亞型β1-、β2-和β3-ARs在組織分布、脫敏機(jī)制和激活特定信號(hào)通路方面各不相同，在控制心臟功能和調(diào)節(jié)免疫活動(dòng)方面發(fā)揮著不同的作用。因此，人們非常希望了解調(diào)節(jié) β-AR 表達(dá)的機(jī)制，以便針對(duì)與 β-AR 失調(diào)相關(guān)的疾病開(kāi)發(fā)出更有效的療法。因此，在開(kāi)發(fā)治療因 β-AR 失調(diào)引起的疾病的方法時(shí)，β-AR 表達(dá)是研究的首要候選對(duì)象。

雖然人們對(duì)激動(dòng)劑介導(dǎo)的人類(lèi)β2-腎上腺素能受體下調(diào)了解很多，但對(duì)人類(lèi) β1-AR下調(diào)的了解卻較少。有趣的是，一些研究表明，氧化應(yīng)激在調(diào)節(jié) β-AR 的表達(dá)中發(fā)揮作用3，包括選擇性地降低小鼠心肌細(xì)胞中 β1 腎上腺素能受體的表達(dá)。

外周苯并二氮雜卓受體（PBR）又名線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（TSPO），在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、線(xiàn)粒體生理機(jī)能和細(xì)胞能量方面起著至關(guān)重要的作用。它還能使壓力過(guò)大的心肌細(xì)胞的細(xì)胞能量和氧化還原平衡正?；?。因此，研究人員假設(shè) PBR 信號(hào)傳導(dǎo)可能參與了細(xì)胞表面 β-AR 密度的調(diào)節(jié)。

為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，他們研究了不同的PBR配體如何影響單核細(xì)胞中β1和β2-AR的表面密度。

合適的研究試劑

抗體特異性顯然是所有研究人員都非常關(guān)注的問(wèn)題。但當(dāng)涉及到 GPCR 等具有挑戰(zhàn)性的靶標(biāo)時(shí)，對(duì)抗體的信心至關(guān)重要。本研究的研究人員使用了Alomone的抗體來(lái)檢測(cè)細(xì)胞表面β1-和β2-腎上腺素能受體的表達(dá)。

研究小組在流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光測(cè)定中使用了FITC 直標(biāo)抗體： Anti-β1-Adrenergic Receptor (extracellular)-FITC Antibody (#AAR-023-F)和Anti-β2-Adrenergic Receptor (extracellular)-FITC Antibody (#AAR-016-F)。由于這些抗體靶向細(xì)胞外表位，設(shè)計(jì)用于識(shí)別小鼠、大鼠和人類(lèi)樣本中的β1和β2腎上腺素能受體，因此他們?cè)诒磉_(dá)β1和β2腎上腺素能受體亞型的細(xì)胞（如人類(lèi)THP-1細(xì)胞）以及缺乏β1-AR、β2-AR或兩種AR的基因敲除（KO）小鼠單核細(xì)胞中進(jìn)行了測(cè)試。

用抗β1-和抗β2-腎上腺素能受體抗體進(jìn)行免疫測(cè)定

(左圖）使用 Anti-β1-Adrenergic Receptor (extracellular) Antibody (#AAR-023)（1:400）對(duì)大鼠背側(cè)劍突核和小鼠小腦進(jìn)行免疫組化染色。A. β1-腎上腺素受體染色（紅色）出現(xiàn)在大鼠背側(cè)劍突核的神經(jīng)元中（水平箭頭）。C. 在小鼠小腦的顆粒細(xì)胞（水平箭頭）和浦肯野細(xì)胞層（垂直箭頭）中檢測(cè)到 β1-腎上腺素受體染色（紅色）。B、D. 用 DAPI 作為反染色劑進(jìn)行核染色（藍(lán)色）。(右圖）使用抗β2-腎上腺素能受體（細(xì)胞外）抗體（#AAR-016）（1:100）對(duì)大鼠肺部石蠟包埋切片進(jìn)行免疫組化染色。β2-腎上腺素受體在呼吸道上皮細(xì)胞中表達(dá)。血色素用作反染色。

流式細(xì)胞儀顯示，抗體清楚地標(biāo)記了細(xì)胞表面內(nèi)源性表達(dá) β-AR 的 THP-1 細(xì)胞中的受體。

現(xiàn)在很清楚，Alomone的β-AR抗體能結(jié)合β-AR，但它們能區(qū)分β1和β2-AR嗎？研究小組利用分離自小鼠的外周血單核細(xì)胞顯示，野生型小鼠細(xì)胞中β1-和β2-AR表達(dá)的MFI值明顯高于KO型小鼠細(xì)胞。Alomone 的 β-AR 抗體成功結(jié)合了 β-AR 并區(qū)分了 β1- 和 β2-AR 亞型?？贵w驗(yàn)證完成后，研究的三個(gè)主要問(wèn)題就開(kāi)始了：β1-AR 和 β2-AR 是否受 β-AR 激動(dòng)劑的不同調(diào)節(jié)？氧化應(yīng)激和 PBR/TSPO 配體對(duì) β-AR 表面密度有影響嗎？造成 β-AR 表達(dá)變化的機(jī)制是什么？

β1-和β2-腎上腺素能受體是否受到不同的調(diào)控？

以前的研究表明，與β2-AR相比，β1-AR對(duì)激動(dòng)劑的下調(diào)具有抵抗力4。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，研究人員用腎上腺素或異丙腎上腺素（一種外源性?xún)翰璺影罚┐碳魏思?xì)胞長(zhǎng)達(dá) 48 小時(shí)。流式細(xì)胞術(shù)和Alomone針對(duì)β-ARs的選擇性抗體顯示，內(nèi)源性β2-腎上腺素能受體的細(xì)胞表面密度降低了，而β1-ARs則不受影響。這種對(duì)β-ARs的不同調(diào)控可能對(duì)開(kāi)發(fā)針對(duì)不同組織中β腎上腺素能受體的治療藥物具有重要意義。

氧化應(yīng)激會(huì)影響β1-和β2-腎上腺素能受體的密度嗎？

之前的研究表明，通過(guò)急性過(guò)氧化氫或慢性多柔比星治療誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激會(huì)降低心肌細(xì)胞中β1-AR的表達(dá)5，基于這一研究，研究小組想看看氧化應(yīng)激是否也會(huì)影響β1-腎上腺素能受體的密度。

研究人員用地x泮（PBR/TSPO 的配體）處理單核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)它導(dǎo)致了 β1-AR 密度的降低，但 β2-AR 的豐度沒(méi)有變化。與β-受體阻滯劑普萘洛爾不同，PBR/TSPO拮抗劑PK1119能夠逆轉(zhuǎn)地x泮的作用，這表明PBR/TSPO參與了β1-ARs細(xì)胞表面密度的調(diào)節(jié)。

這一發(fā)現(xiàn)表明，對(duì)β-ARs的影響實(shí)際上并非由氧化應(yīng)激介導(dǎo)，因?yàn)樵诘豿泮處理后沒(méi)有觀察到氧和氮自由基的產(chǎn)生發(fā)生變化。

β1-腎上腺素能受體密度變化背后的機(jī)制是什么？

到目前為止，我們已經(jīng)看到，β1-和β2-AR 在單核細(xì)胞中確實(shí)受到不同程度的調(diào)節(jié)，β1-AR 對(duì)激動(dòng)劑介導(dǎo)的下調(diào)具有更強(qiáng)的抵抗力。相反，暴露于地x泮后，β1-AR 密度降低，我們發(fā)現(xiàn) PBR 拮抗劑 PK11195 可拮抗這種效應(yīng)。為了推斷這些結(jié)果的機(jī)制，研究人員研究了地x泮如何影響轉(zhuǎn)錄和受體合成，以及單核細(xì)胞對(duì) GRK-2 的表達(dá)，GRK-2 是一種參與 β 腎上腺素能受體脫敏和內(nèi)化的激酶6。他們還研究了地x泮對(duì)β1和β2腎上腺素能受體與Gα蛋白亞基或β-arrestin-2相互作用的影響。

有趣的是，他們發(fā)現(xiàn)地x泮對(duì)β1-AR或GRK-2的mRNA或蛋白水平均無(wú)影響，也不影響β-AR亞型與Gα蛋白或β-arrestin-2的相互作用。然而，PBR/TSPO在調(diào)節(jié)β1-AR表面密度方面的作用似乎很明顯。因此，研究人員推測(cè)地x泮可能會(huì)通過(guò)改變其向質(zhì)膜的再循環(huán)來(lái)影響β1-AR的表面密度。

對(duì)心血管的影響

這項(xiàng)研究為了解β-AR行為和相互作用的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制提供了重要見(jiàn)解。考慮到β-AR在心血管治療中的重要性（例如以β-受體阻滯劑的形式），這些研究結(jié)果表明，靶向PBR/TSPO可能是調(diào)節(jié)β1-AR表達(dá)的一種有前途的策略。

這項(xiàng)研究還強(qiáng)調(diào)了驗(yàn)證抗體的重要性，即使是高度特異性的抗體也需要驗(yàn)證！Alomone 的抗體能讓您靈活地使用多種免疫測(cè)定來(lái)揭示最復(fù)雜的機(jī)制。

文章部分相關(guān)產(chǎn)品

靶向膜結(jié)合受體具有挑戰(zhàn)性。這就是Alomone幾十年來(lái)一直在內(nèi)部生產(chǎn)和驗(yàn)證一系列抗體的原因。如果您喜歡這篇文章討論的研究，您可能會(huì)對(duì)以下這些du特的工具感興趣：

關(guān)于Alomone

Alomone是來(lái)自以色列的離子通道專(zhuān)家，提供與離子通道和膜蛋白（TRP通道、鈉/鉀/鈣通道、水通道、GPCRs）相關(guān)的抗體、拮抗劑/激動(dòng)劑（小分子化合物和毒素）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等。

優(yōu)寧維作為Alomone在中國(guó)區(qū)的du家授權(quán)代理商，建立了中國(guó)現(xiàn)貨庫(kù)，為廣大客戶(hù)帶去更快的物流，更好的服務(wù)。

References

1.Matarrese P, Maccari S, Gambardella L, Vona R, Barbagallo F, Vezzi V, Stati T, Grò MC, Giovannetti A, Catalano L, Molinari P, Marano G, Ambrosio C. Benzodiazepine diazepam regulates cell surface β1-adrenergic receptor density in human monocytes. Eur J Pharmacol. 2023 Jun 5;948:175700. doi: 10.1016/j.ejphar.2023.175700. Epub 2023 Mar 29. PMID: 37001579.

2.Gainetdinov RR, Premont RT, Bohn LM, Lefkowitz RJ, Caron MG. Desensitization of G protein-coupled receptors and neuronal functions. Annu Rev Neurosci. 2004;27:107-44. doi: 10.1146/annurev.neuro.27.070203.144206. PMID: 15217328.

3.Zhu J, Steinberg SF. β1-adrenergic receptor N-terminal cleavage by ADAM17; the mechanism for redox-dependent downregulation of cardiomyocyte β1-adrenergic receptors. J Mol Cell Cardiol. 2021 May;154:70-79. doi: 10.1016/j.yjmcc.2021.01.012. Epub 2021 Feb 6. PMID: 33556394; PMCID: PMC8068644.

4.Liang W, Austin S, Hoang Q, Fishman PH. Resistance of the human beta 1-adrenergic receptor to agonist-mediated down-regulation. Role of the C terminus in determining beta-subtype degradation. J Biol Chem. 2003 Oct 10;278(41):39773-81. doi: 10.1074/jbc.M304482200. Epub 2003 Jul 29. PMID: 12888573.

5.Park M, Steinberg SF. Carvedilol Prevents Redox Inactivation of Cardiomyocyte Β1-Adrenergic Receptors. JACC Basic Transl Sci. 2018 Aug 28;3(4):521-532. doi: 10.1016/j.jacbts.2018.06.002. PMID: 30175276; PMCID: PMC6116783.

6.Iaccarino G, Ciccarelli M, Sorriento D, Galasso G, Campanile A, Santulli G, Cipolletta E, Cerullo V, Cimini V, Altobelli GG, Piscione F, Priante O, Pastore L, Chiariello M, Salvatore F, Koch WJ, Trimarco B. Ischemic neoangiogenesis enhanced by beta2-adrenergic receptor overexpression: a novel role for the endothelial adrenergic system. Circ Res. 2005 Nov 25;97(11):1182-9. doi: 10.1161/01.RES.0000191541.06788.bb. Epub 2005 Oct 20. PMID: 16239589.