2021年8月19日，張鋒團(tuán)隊(duì)在學(xué)術(shù)期刊Science上發(fā)表了題為：Mammalian retrovirus-like protein PEG10 packages its own mRNA and can be pseudotyped for mRNA delivery 的研究論文。

研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種全新的RNA遞送平臺——SEND（Selective Endogenous eNcapsidation for cellular Delivery），SEND的核心是逆轉(zhuǎn)錄病毒樣蛋白PEG10，它能夠與自身的mRNA結(jié)合并在其周圍形成球型保護(hù)囊。研究團(tuán)隊(duì)將其改造設(shè)計(jì)后用來包裝和遞送RNA，使用SEND系統(tǒng)將CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)遞送給小鼠和人類細(xì)胞并成功編輯了目標(biāo)基因，這將為基因治療提供一種全新的遞送載體。SEND系統(tǒng)是利用人類內(nèi)的組分自組裝為病毒樣顆粒，與其他遞送載體相比，所引起的免疫反應(yīng)更少，更具安全性。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞形成Gag同源物的計(jì)算篩選

為了鑒定具有轉(zhuǎn)移特定核酸潛力的基因，研究人員專注于包含核心衣殼(CA)結(jié)構(gòu)域的Gag同源物，該結(jié)構(gòu)域保護(hù)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和外源逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組?；蚪M分析確定了哺乳動(dòng)物基因組中的許多內(nèi)源性Gag同源物，形成分泌在細(xì)胞外囊泡內(nèi)的衣殼樣顆粒（EVs）。

圖1 鑒定形成衣殼并被分泌的哺乳動(dòng)物逆轉(zhuǎn)錄元件衍生的Gag同源物

MmPEG10 結(jié)合并分泌其自身的mRNA

為了確定這些蛋白質(zhì)是否在EV內(nèi)分泌，研究人員在人胚胎腎（HEK）293 FT細(xì)胞中過表達(dá)每個(gè)含CA基因的表位標(biāo)記小鼠直向同源物，并收集全細(xì)胞裂解物和病毒樣顆粒（VLP）。

圖2 MmPEG10蛋白和mRNA在體外由細(xì)胞分泌到囊泡中

結(jié)果表明，MmMOAP1、MmArc、MmPEG10和MmRTL1都存在于VLP級分中，但MmPEG10是VLP級分中豐富的蛋白質(zhì)。此外，內(nèi)源性MmPEG10，很容易在無細(xì)胞成年小鼠血清中檢測到。

接下來，研究人員使用RNA測序測試了由Gag同源物形成的任何衣殼樣顆粒是否包含特定的mRNA。發(fā)現(xiàn)MmPeg10轉(zhuǎn)錄激活導(dǎo)致可觀數(shù)量的全-VLP部分中的長度MmPeg10 mRNA轉(zhuǎn)錄本。

圖3 帶有MmPeg10的5和3’UTR的側(cè)翼mRNA能夠?qū)RNA功能性地細(xì)胞間轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中

PEG10是一個(gè)進(jìn)行RNA傳遞的模塊化平臺

為了生成內(nèi)源性的SEND系統(tǒng)，研究人員測試了VSVg是否可以被內(nèi)源性融合跨膜蛋白替代。鑒于MmPeg10/HsPEG10和合胞素基因的重疊組織表達(dá)，還測試了用MmSYNA或MmSYNB對小鼠SEND系統(tǒng)進(jìn)行假型與使用VSVg進(jìn)行假型的可行性。結(jié)果表明，這種細(xì)胞類型適合通過這些融合素進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。

研究人員將轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)劑vectofusin-1添加到MmSYNA和MmSYNB顆粒的上清液中，以增強(qiáng)體外轉(zhuǎn)導(dǎo)。在這些原代細(xì)胞中，VSVg和MmSYNA都啟用了SEND介導(dǎo)的Mm.cargo(Cre)功能轉(zhuǎn)移，而MmSYNB則沒有。

同樣，這種包裝是高度特異性的，因?yàn)橹挥蠻TR側(cè)翼的mRNA[即Mm.cargo(Cre)]被功能轉(zhuǎn)移。與MmSYNA一起，SEND可以配置為功能基因轉(zhuǎn)移的完quan內(nèi)源系統(tǒng)。

圖4 SEND 是一個(gè)模塊化系統(tǒng)，能夠?qū)⒒蚓庉嫻ぞ邆鬟f到人類和小鼠細(xì)胞中

之后研究人員開始探索MmPEG10介導(dǎo)的MmPeg10 RNA在神經(jīng)元中的內(nèi)源性作用。攜帶天然PEG10轉(zhuǎn)錄本的MmSYNA假型VLP的功能轉(zhuǎn)移到原代小鼠皮層神經(jīng)元，導(dǎo)致許多參與神經(jīng)發(fā)育的基因上調(diào)。

為了進(jìn)一步表征該系統(tǒng)組件的模塊化，研究人員測試了不同的貨物RNA。測試了SEND 是否可以介導(dǎo)大約5kb Mm.cargo（SpCas9）的功能轉(zhuǎn)移到N2a細(xì)胞系中，這些細(xì)胞系組成性表達(dá)針對MmKras的單一向?qū)NA（sgRNA）。

SEND能夠在功能上轉(zhuǎn)移SpCas9，導(dǎo)致受體細(xì)胞中約60%的插入和缺失（indels）；與Cre的結(jié)果相似，SEND是特異性的，只能有效地功能轉(zhuǎn)移SpCas9，兩側(cè)是全長或優(yōu)化的Peg10 UTR序列。

為了創(chuàng)建用于遞送sgRNA和SpCas9的多合一載體，研究人員測試了SEND是否可以有效遞送sgRNA。并將它們與表達(dá)Cas9的N2a細(xì)胞一起孵育；即使直接轉(zhuǎn)染向?qū)э@示強(qiáng)大的插入缺失形成，也可以檢測到非常少的活性。

圖5 SEND是一個(gè)模塊化系統(tǒng)，能夠?qū)⒒蚓庉嫻ぞ邆鬟f到人類和小鼠細(xì)胞中

作者表示SEND技術(shù)可以補(bǔ)充現(xiàn)有的病毒遞送載體和脂質(zhì)納米顆粒，以擴(kuò)展向細(xì)胞遞送基因和編輯療法的工具箱。

參考文獻(xiàn)：

1.Segel M, Lash B, Song J, Ladha A, Liu CC, Jin X, Mekhedov SL, Macrae RK, Koonin EV, Zhang F. Mammalian retrovirus-like protein PEG10 packages its own mRNA and can be pseudotyped for mRNA delivery. Science. 2021 Aug 20;373(6557):882-889.