細(xì)胞培養(yǎng)，是人工創(chuàng)造與體內(nèi)生長(zhǎng)相似的環(huán)境，使細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)。培養(yǎng)基是一切體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)，為細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)提供了各種必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的常見問(wèn)題，小優(yōu)在之前已經(jīng)給大家分享過(guò)血清篇了，想要了解的小伙伴可以點(diǎn)擊此處。今天小優(yōu)就給大家?guī)?lái)該系列的第二篇——經(jīng)典液體培養(yǎng)基的介紹以及常見問(wèn)題解答，快叫上你的實(shí)驗(yàn)搭子一起來(lái)看看吧~

01培養(yǎng)基的前世今生

根據(jù)培養(yǎng)基的來(lái)源和組成成分，它的發(fā)展經(jīng)歷了三個(gè)階段，分別是天然培養(yǎng)基階段、合成培養(yǎng)基階段以及無(wú)血清培養(yǎng)基階段。

在20世紀(jì)50年代，當(dāng)時(shí)體外培養(yǎng)普遍直接采用組織凝塊、生物性液體和組織提取液，如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸液等，這就是天然培養(yǎng)基階段。由于天然培養(yǎng)基的使用會(huì)帶來(lái)不可避免的病毒污染、批次間差異大等問(wèn)題，于是就有了合成培養(yǎng)基，其主要成分包括生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、緩沖劑、抗生素等。合成培養(yǎng)基最初的配方是MEM，由Eagle在1959年提出，之后經(jīng)過(guò)不斷發(fā)展涌出了各種不同配方的優(yōu)質(zhì)合成培養(yǎng)基，包括M199、DMEM、IMDM、PRMI1640等，這些經(jīng)典培養(yǎng)基到現(xiàn)在依舊是實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用廣泛的。

由于天然培養(yǎng)基的一些營(yíng)養(yǎng)成分不能被合成培養(yǎng)基完quan代替，因此一般需要在完quan培養(yǎng)基中添加血清成分。然而，在一些時(shí)刻血清的添加也同樣面臨了挑戰(zhàn)，如因?qū)嶒?yàn)需要控制培養(yǎng)體系中的外源蛋白含量時(shí)、實(shí)驗(yàn)需要完quan排除血清批間差異的影響時(shí)，另外血清昂貴的價(jià)格也使科研人員們不斷尋求一種培養(yǎng)效果相同的全新方案。因此，無(wú)血清培養(yǎng)基應(yīng)運(yùn)而生，目前已經(jīng)發(fā)展到化學(xué)成分限定培養(yǎng)基階段了。

以上就是培養(yǎng)基的前世今生了，當(dāng)然我們科研小伙伴用的最多的還是一些經(jīng)典的合成培養(yǎng)基，按照物理性質(zhì)可將其分為：液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、脫水培養(yǎng)基。其中，液體培養(yǎng)基最為常見，它具有可進(jìn)行通氣培養(yǎng)或振蕩培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗牧鲃?dòng)性便于精確控制培養(yǎng)基的溶液溫度、營(yíng)養(yǎng)濃度和氣體含量等；它對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)的附著能力要求小，細(xì)胞可快速擴(kuò)增；當(dāng)需要大量細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)也更經(jīng)濟(jì)高效。作為大家使用最為頻繁的細(xì)胞培養(yǎng)試劑，基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)中起到關(guān)鍵作用，接下來(lái)就給大家介紹一下它的種類和配方差異。

02 基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基的組分

為了滿足細(xì)胞的生長(zhǎng)需要，液體培養(yǎng)基一般都會(huì)含有水、能源物質(zhì)、氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽和pH指示劑等。此外，還可能含有血清或血清替代成分。

? 水

液體細(xì)胞培養(yǎng)基中90 %以上的成份是水。細(xì)胞對(duì)水的品質(zhì)非常敏感，水的品質(zhì)將直接影響細(xì)胞培養(yǎng)的效果。因此，細(xì)胞培養(yǎng)用水須經(jīng)過(guò)純化，品質(zhì)應(yīng)符合中國(guó)藥典注射用水標(biāo)準(zhǔn)或者超純水的標(biāo)準(zhǔn)。

? 能源物質(zhì)

液體培養(yǎng)基的能源物質(zhì)以葡萄糖為主，少數(shù)含有半乳糖、果糖、甘露糖等。根據(jù)葡萄糖含量不同區(qū)分，代謝消耗較快的病理狀態(tài)細(xì)胞多選用高糖（4.5 g/L）培養(yǎng)基，單抗細(xì)胞融合時(shí)使用低糖（1.0 g/L）培養(yǎng)基。當(dāng)葡萄糖不足時(shí)，可以使用丙酮酸鈉為細(xì)胞提供碳源，并且部分細(xì)胞系對(duì)丙酮酸鈉具有依賴性。

? 氨基酸

氨基酸是蛋白質(zhì)合成的基礎(chǔ)，不同細(xì)胞需要的氨基酸類型具有差異性。谷氨酰胺是一種氨基酸，也是一種重要能源物質(zhì)，但要注意它在溶液中不穩(wěn)定，代謝產(chǎn)物會(huì)損傷敏感細(xì)胞系。

? 維生素

維生素參與酶構(gòu)成，是維持細(xì)胞生長(zhǎng)的生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞代謝中起調(diào)節(jié)及控制作用。

? 無(wú)機(jī)鹽

無(wú)機(jī)鹽的主要作用就是維持滲透壓平衡，調(diào)節(jié)pH。

? 緩沖體系

細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中造成培養(yǎng)基 pH 波動(dòng)的主要物質(zhì)是細(xì)胞代謝產(chǎn)生的CO2，液體培養(yǎng)基通常采用NaHCO3或HEPES緩沖體系來(lái)為細(xì)胞生長(zhǎng)提供穩(wěn)定的pH環(huán)境。

? 酚紅：酸堿指示劑。

03 基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基的類型

小優(yōu)在這里為大家整理了一些實(shí)驗(yàn)室常用經(jīng)典液體培養(yǎng)基的類型，建議小伙伴們收藏保存！

04 基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基的常見問(wèn)題

Q1：液體培養(yǎng)基為什么顏色不一樣？

A1：酚紅加量不同，導(dǎo)致顏色差異：DMEM ＞MEM ＞ DMEM/F12 ＞ RPMI1640＞F12 & F10。

Q2：培養(yǎng)基放冰箱里顏色變深？

A2：空氣中CO2濃度低，培養(yǎng)基內(nèi)CO2會(huì)逐漸溢出，HCO3-減少，造成培養(yǎng)基偏堿。

Q3：含有谷氨酰胺培養(yǎng)基的保存條件？

A3：谷氨酰胺對(duì)溫度敏感，溫度越高降解速度越快。谷氨酰胺在溶液中不穩(wěn)定，單獨(dú)保存應(yīng)置于-20℃冰箱中。加有谷氨酰胺的液體培養(yǎng)基應(yīng)存放在2°C–8°C，或者購(gòu)買不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基使用時(shí)添加。

Q4：液體培養(yǎng)基可以放-20℃及以下保存嗎？

A4：不可以。在-20℃下，培養(yǎng)基中的鹽容易析出，培養(yǎng)基融化后，有些鹽無(wú)法重新溶解，從而導(dǎo)致滲透壓降低。液體培養(yǎng)基放在2-8℃長(zhǎng)期保存。液體培養(yǎng)基保存要避光。培養(yǎng)基中的某些成分遇光會(huì)產(chǎn)生過(guò)氧化氫，具有細(xì)胞毒性。

Q5：購(gòu)買的液體培養(yǎng)基可以保存多久？

A5：理論上只要保存得當(dāng)，保質(zhì)期范圍之內(nèi)都可以用。但實(shí)際開瓶后保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致液體培養(yǎng)基中鹽分的析出和pH值的改變，因此建議開瓶后盡快用完。

Q6：更換培養(yǎng)基后細(xì)胞長(zhǎng)不好？

A6：

（1）各廠家培養(yǎng)基配方并非全相同，可能細(xì)胞已經(jīng)適應(yīng)當(dāng)前的培養(yǎng)體系；

（2）原代細(xì)胞更容易適應(yīng)新的培養(yǎng)基，而傳代細(xì)胞系更換比較難；

（3）剛復(fù)蘇的細(xì)胞不要用來(lái)適應(yīng)新培養(yǎng)基，細(xì)胞活率低，待狀態(tài)穩(wěn)定后再用來(lái)馴化；

（4）敏感性細(xì)胞適應(yīng)培養(yǎng)基，需要多馴化幾代，期間細(xì)胞死亡數(shù)量減少，生長(zhǎng)緩慢是正?，F(xiàn)象。

Q7：DPBS和PBS有什么區(qū)別，能通用嗎？

A7：都屬于磷酸鹽緩沖液，成分上只有一點(diǎn)點(diǎn)磷酸鹽的含量差異，均有等滲和調(diào)節(jié)pH的功能，大多數(shù)對(duì)于細(xì)胞的使用上可以通用。

Q8：HBSS 和PBS/DPBS有什么區(qū)別？

A8：HBSS緩沖液中鹽成分較PBS和DPBS更復(fù)雜，且含有葡萄糖，可為細(xì)胞提供簡(jiǎn)單的營(yíng)養(yǎng)，而PBS/DPBS不能提供營(yíng)養(yǎng)。

寫在最后：

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• 經(jīng)典培養(yǎng)基質(zhì)量控制

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