細胞培養(yǎng)是每個實驗者都會使用的技術(shù)，但是細胞在培養(yǎng)過程中常受到許多不同來源的污染，如細菌、真菌、支原體和內(nèi)毒素污染等等，其中支原體污染最難發(fā)現(xiàn)和處理。綜合FDA、ATCC等機構(gòu)收集到的相關(guān)數(shù)據(jù)，世界各國細胞系支原體污染的平均比例為30-60%。它們不僅與宿主競爭營養(yǎng)，還會掩蓋一些化合物毒性影響，因此細胞受到支原體污染后不但會抑制生長和新陳代謝、改變DNA轉(zhuǎn)染效率，甚至最終會導(dǎo)致細胞死亡，嚴重影響實驗結(jié)果的可靠性、重復(fù)性及一致性，所以在實驗中定期做好支原體預(yù)防、檢測和清除極為關(guān)鍵。

支原體污染細胞狀態(tài) 圖片來源網(wǎng)絡(luò)

什么是支原體？

支原體模式圖 圖片引自David S. Goodsell手繪

支原體又稱霉形體，是目前發(fā)現(xiàn)最微小、能夠自我復(fù)制且不具有細胞壁的原核生物，直徑大小僅為50-300nm，可通過濾菌器； 支原體可分為口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體、發(fā)酵支原體、人型支原體、唾液支原體、肺支原體和梨支原體等多種類型。

支原體污染對細胞的危害

●抑制細胞生長和新陳代謝；

●干擾核酸合成，染色體畸變；

●改變細胞膜抗原性，并可能改變DNA轉(zhuǎn)染效率；

●增加了對凋亡誘導(dǎo)物的敏感性；

●細胞死亡。

圖片引自Lonza

支原體污染來源

典型的支原體污染來源比較廣泛，通常包括以下幾種來源：

●未檢測細胞之間交叉污染；

●實驗室環(huán)境或?qū)嶒炂鞑牡闹苯游廴荆?/span>

●培養(yǎng)基或其他試劑污染；

●實驗人員無菌操作不當；

●制備細胞的組織或器官產(chǎn)生污染。

支原體污染的特性

一般細胞被支原體污染了幾個月都沒有被發(fā)現(xiàn)，支原體污染之所以很難檢測和預(yù)防，是因為其具有非常高的隱蔽性，具體如下：

●體積非常小，即使在支原體高濃度（>107 cfu/ml）下，顯微鏡下也不可見；

●相對于細菌污染，支原體污染不會引起渾濁或PH值改變等可見變化；

●大部分用于細胞常規(guī)培養(yǎng)的抗生素對支原體無效；

●常規(guī)的過濾也無法去除支原體。

如何預(yù)防支原體污染？

如何進行安全的細胞培養(yǎng)并預(yù)防支原體的污染呢？優(yōu)寧維為大家總結(jié)了十個技巧：

●穿戴適當?shù)膫€人防護設(shè)備(手套、專用的干凈實驗服、護目鏡)并消毒手套

●在細胞處理開始前以及處理不同細胞系之間擦拭安全柜中的工作桌面

●避免在你的細胞上說話或打噴嚏

●避免飛濺、溢出和氣溶膠

●為每個細胞系使用zhi定的培養(yǎng)基瓶

●定期清潔培養(yǎng)箱，包括水盤

●定期清空及清潔水浴設(shè)備

●細胞復(fù)蘇幾天后測試新細胞培養(yǎng)物的支原體污染

●隔離所有進入實驗室的細胞培養(yǎng)物,直到它們經(jīng)過支原體檢測

●不要忘記：每2周進行一次支原體的常規(guī)檢測

如何檢測和清除支原體污染？

一般來說，新的細胞株都需要做支原體檢測，細胞培養(yǎng)期間，建議每1-2周進行一次支原體檢測以防止污染。因此，在實驗室的日常研究需求中，需要一種快速、全面的檢測方法以應(yīng)對日常的檢測需求。

支原體檢測——Lonza MycoAlert™支原體快檢

1、檢測原理

目前，在95%支原體污染來自6個種屬，在這些種屬和大多數(shù)的柔膜細菌中，存在兩種酶，乙酸激酶和氨基甲酸激酶，MycoAlert™通過檢測兩種酶的活性，完成支原體檢測。僅需兩步簡單操作，20分鐘即可完成檢測。這兩種酶在真核細胞中不存在，因此，既可保證檢測的準確性，又可快速完成檢測。

2、檢測方法

3、數(shù)據(jù)解讀

4、產(chǎn)品優(yōu)勢

1.只需兩步操作，20分鐘內(nèi)出結(jié)果；

2.生物發(fā)光技術(shù)，無需抽提DNA；

3.MycoAle-t™ PLUS試劑盒可用于低敏板式發(fā)光儀或多功能發(fā)光儀上；

4.可檢測所有常規(guī)的支原體和甾原體的污染

5.可檢測44種柔膜菌綱（支原體）物種

6.適用于研究中細胞培養(yǎng)環(huán)境的篩選

7.適用于檢測新的培養(yǎng)基，水，添加物（如血清等）

支原體清除——Lonza MycoZap™支原體去除試劑

支原體無法通過無菌過濾去除。由于支原體沒有細胞壁，常規(guī)的細胞培養(yǎng)抗生素（如青霉素）對它也不起作用。多數(shù)情況實驗者丟棄已污染樣品。但是有時實驗者出于某些原因不能丟棄已污染的樣品，就可以通過MycoZap™支原體去除試劑在4天內(nèi)清除支原體。挽救他們的樣品。

1、作用原理

它通過抗生素和抗代謝藥劑的共同作用來終止支原體。這種方法高效可靠的去除支原體，解決單獨的抗生素對支原體不起作用的問題。MycoZap™支原體試劑可清除細胞培養(yǎng)中的柔膜綱污染包括支原體、甾原體、螺原體、蟲原體。

2、使用方法

1.在25cm2的培養(yǎng)瓶中添加4.5 ml培養(yǎng)基（胎牛血清<5%）；

2.在培養(yǎng)基中加入500µl的MycoZap™ reagent 1，輕輕旋轉(zhuǎn)混合；

3.在培養(yǎng)基(含5% (v/v)胎牛血清)中制備細胞懸液，細胞密度為105個/ml；

4.向MycoZap™培養(yǎng)基混合液中加入5 ml細胞懸液；

5.根據(jù)細胞增殖速率，正常孵育2-6天；

6.在傳代之前，取2ml細胞培養(yǎng)上清液，用MycoAlert™試劑盒進行檢測；

7.將細胞正常傳代至9.5ml新鮮培養(yǎng)基中；

8.向細胞中加入500µl的MycoZap™ reagent 2；

9.檢測陰性后即可正常培養(yǎng)細胞。

3、產(chǎn)品優(yōu)勢

1.全面、徹di的支原體去除試劑

●消滅支原體、甾原體、螺原體、蟲原體

●通過抗生素與抗代謝藥劑的聯(lián)合作用有效去除柔膜綱物種

2.有效而溫和

●細胞毒性最小化

●廣泛地適用于細胞培養(yǎng)

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參考文獻

1.Drexler HG, Uphof CC (2002) Mycoplasma contamination of celcultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology 39: 75–90

2.Koshimizu K, Kotani H (1981). In: Procedures for the Isolation and Identification of Human, Animal and Plant Mycoplasmas (Nakamura, M., ed.), Saikon, Tokyo, 87–102.

3.Gong H, Z?lzer F, von Recklinghausen G, R?ssler J, Breit S, Havers W, FotsisT, Schweigerer L (1999) Arginine deiminase inhibits cell proliferation by arresting cell cycle and inducing apoptosis. Biochem Biophys Res Comm 261: 10–14.

4.Ben-Menachem G, Mousa A, Brenner T, Pinto F, Z?hringer U, Rottem S (2001)Choline deficiency induced by Mycoplasma fermentans enhances apoptosis of rat astrocytes. FEMS Microbiol Letters 201: 157–162

5.McGarrity MF, Vanaman V, Sarama J (1984) Cyto genetic effects of mycoplasmal infection of cell cultures: a review. In Vitro 20: 1–18

6.Sokolova IA, Vaughan ATM, Khodarev NN (1998) Mycoplasma infection can sensitize host cells to apoptosis through contribution of apoptotic- like endonuclease(s). Immunol Cell Biol 76: 526–534

7.Doersen CJ, Stanbridge EJ (1981) Effects of mycoplasma contamination on phenotypic expression of mitochondrial mutants in human cells. Mol Cell Biol 1: 321–329

8.Stanbridge EJ (1971) Mycoplasmas and cell cultures. Bacteriological Reviews 35): 206–227

9.Darin N, Kadhom N, Brière JJ, Chretien D, Bébéar CM, R?tig A, Munnich A, Rustin P (2003) Mitochondrial activities in human cultured skin fi broblasts contaminated by Mycoplasma hyorhinis. BMC Biochem 4:15

10.Rottem S (2003) Interaction of mycoplasmas with host cells. Physiol Rev 83: 417–432

11.Miller CJ, Kassem HS, Pepper SD, Hey Y, Ward TH, Margison GP. (2003) Mycoplasma infection significantly alters microarray gene expression profiles. Biotechniques 35: 812–814