小G蛋白，是具有GTP酶活性的一類蛋白，因其分子量只有20—30KD而得名。第一個被發(fā)現(xiàn)的小G蛋白是Ras，它是Ras基因的產(chǎn)物。根據(jù)序列的同源性，小G蛋白被分成若干亞家族，例如Rho，Ras，Ran，Rab，Arf和Rad / Rem / Gem / Kir。

小G蛋白家族成員在細(xì)胞信號通路中具有分子開關(guān)的功能，并參與調(diào)控許多生物學(xué)過程。下面小優(yōu)就帶大家一起來看看小G蛋白具體的功能以及研究方法吧～

Part1 小G蛋白的功能

1、Rho 亞家族

Rho 亞家族由 20 多個成員組成，目前研究得最多的是 Rac1、RhoA 和 Cdc42 蛋白。 Rho 蛋白主要通過一系列效應(yīng)蛋白傳遞細(xì)胞信號，從而參與了廣泛的細(xì)胞反應(yīng)，包括細(xì)胞骨架重組1-2、轉(zhuǎn)錄調(diào)控3、細(xì)胞遷移4、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移5。

Rac1是一種分子量為21kDa的GTPase，由192個氨基酸編碼組成。Rac1在多種細(xì)胞活動中起分子開關(guān)作用，包括細(xì)胞運動、發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架組織、免疫反應(yīng)、細(xì)胞周期、細(xì)胞間粘附、上皮分化，以及控制GLUT4轉(zhuǎn)運以攝取葡萄糖。

RhoA 蛋白由 193 個氨基酸組成，分子量約為 22 kDa ，在調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架的動態(tài)組織（如聚合、肌動蛋白收縮性、應(yīng)力纖維形成）以及調(diào)控依賴于動態(tài)肌動蛋白細(xì)胞骨架的細(xì)胞功能發(fā)揮著重要作用。此外，RhoA 還參與微管動力學(xué)的調(diào)控過程。

Cdc42是一個21.3 kDa的小GTPase蛋白，由191個氨基酸編碼。Cdc42在多種依賴于肌動蛋白細(xì)胞骨架的細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，如胞質(zhì)分裂、吞噬、細(xì)胞遷移、形態(tài)發(fā)生、趨化、軸突引導(dǎo)、軸突成髓鞘、細(xì)胞內(nèi)運輸、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞命運決定等。

2、Ras 亞家族

Ras亞家族大約有 10 個成員，分為 Ras、Ral 和 Rap 蛋白。Ras 蛋白在控制增殖和分化的 Raf/ERK 信號通路中發(fā)揮作用；Ral 蛋白在內(nèi)吞作用的早期階段發(fā)揮作用； Rap 蛋白則是 Ras 蛋白的拮抗劑，它們位于晚期核內(nèi)體和早期溶酶體區(qū)。

K-Ras 是三種 Ras 致癌異構(gòu)體之一（其他兩種為 N-Ras 和 H-Ras），由 189 或 188 個氨基酸組成，分子量為 21 kDa。與其他小G蛋白一樣，K-Ras在非活性（GDP 結(jié)合）和活性（GTP 結(jié)合）狀態(tài)之間循環(huán)，是許多不同信號級聯(lián)和細(xì)胞過程的分子開關(guān)。K-Ras 參與不同類型的配體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，通過向細(xì)胞質(zhì)和核仁傳遞有絲分裂和生長信號，影響細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)化和凋亡。

3、Ran 亞家族

Ran 蛋白調(diào)節(jié)大分子的核運輸，并在從 DNA 復(fù)制到進(jìn)入有絲分裂的細(xì)胞周期檢查點中起作用。

4、Rab 亞家族

作為最大的小 G 蛋白亞家族之一，Rab 蛋白調(diào)節(jié)著囊泡從 ER 到高爾基體再到質(zhì)膜的流動過程，它們普遍表達(dá)，并且含量高。

5、Arf 亞家族

Arf 家族由 Arf 蛋白和類 Arf 蛋白（Arl's）組成6，它是小 G 蛋白家族中分歧最大的，與異源三聚體 G 蛋白家族有相同的親緣關(guān)系。Arf 蛋白在核膜融合、高爾基體囊泡轉(zhuǎn)運負(fù)調(diào)控和質(zhì)膜內(nèi)陷過程中起到協(xié)助作用。

6、Rad/Rem/Gem/Kir 亞家族

RGK 亞家族的成員具有廣泛的功能，如控制心肌肥大、抑制肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞系中胰島素刺激的葡萄糖的攝取，以及通過與 b-亞基結(jié)合抑制電壓依賴性鈣通道7。

Part2 小G蛋白的研究工具

針對小G蛋白的研究有多種方式，如測量活化的“GTP結(jié)合"形式、測量小G蛋白的總蛋白水平、 測定GTP和GDP之間互相轉(zhuǎn)換的活性（Guanine exchange factors，GEFs，鳥嘌呤核苷酸交換因子）、測定內(nèi)源性GTP酶速率，下面小優(yōu)就為大家分別介紹這幾種測量方法以及相關(guān)的研究工具。

1、小G蛋白的 GTP 結(jié)合活性測定

小G蛋白的活性測定有兩種方法：pull-down和G-LISA。以Rho蛋白的活性測定為例，pull-down法就是將 Rho 效應(yīng)子的 Rho-GTP 結(jié)合域 (RBD) 與瓊脂糖珠耦合，以親和力為基礎(chǔ)檢測生物樣本中的活性 Rho8。這種方法有幾個缺點，如耗時長、需要大量細(xì)胞的總蛋白、可同時處理的樣本數(shù)量有限以及只能得出半定量結(jié)果。Cytoskeleton 推出的 G-LISA 技術(shù)將這一概念的準(zhǔn)確性和靈敏度提升到了一個新的水平，該技術(shù)使用 96 孔格式和少量細(xì)胞/蛋白質(zhì)，可提供高度準(zhǔn)確的結(jié)果。

表：Pull down試劑盒 & G-LISA™試劑盒的對比

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2、小 G 蛋白總含量測定

小 G 蛋白的總水平曾一度被認(rèn)為是細(xì)胞信號傳導(dǎo)中無關(guān)緊要的旁觀者，但科學(xué)家經(jīng)過后續(xù)的研究，已經(jīng)證實其是影響正常和患病細(xì)胞功能的真正因素。使用 WB或ELISA可以測量細(xì)胞或組織提取物中的小 G 蛋白總含量。

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3、GEF活性測定

GEF（Guanine exchange factors，鳥嘌呤核苷酸交換因子） 催化 GDP 與 GTP 的交換，使小 GTP 酶在細(xì)胞外信號的作用下產(chǎn)生活性。為了促進(jìn)交換，GEF 必須與GDP - GTP 酶結(jié)合，從而破壞 GDP-GTP 酶復(fù)合物的穩(wěn)定性，然后穩(wěn)定無核苷酸的反應(yīng)中間體。由于細(xì)胞內(nèi) GTP 與 GDP 的比例很高，釋放出的 GDP 會被 GTP 取代，從而導(dǎo)致 GEF 從復(fù)合物中釋放出來并激活 GTP 酶。許多 GEF 蛋白已被確認(rèn)為致癌基因，并與癌癥等人類疾病有關(guān)。然而，由于GEF 蛋白的表達(dá)具有組織或細(xì)胞類型特異性，因此研究小G蛋白能為癌癥治療提供新的研究方向。

最近開發(fā)的鳥嘌呤核苷酸熒光類似物大大提高了確定 GEFs 實時交換反應(yīng)的能力，包括動力學(xué)和熱力學(xué)性質(zhì)，從而無需使用傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記方法。這種基于熒光的檢測方法利用了鳥嘌呤核苷酸的結(jié)合和非結(jié)合熒光類似物之間的光譜差異，因此能夠監(jiān)測小 GTP 酶的狀態(tài)。廣泛使用的熒光類似物之一是mant熒光團(tuán)，它在360nm處被激發(fā)，在440nm處發(fā)出熒光。一旦與 GTPases 結(jié)合，mant熒光團(tuán)的發(fā)射強度會急劇增加約 2 倍，因此，小 GTP 酶和 GEF 存在時熒光強度的增強將反映出已知或未知蛋白質(zhì)各自的 GEF 活性。

下圖展示了一種基于Mant熒光團(tuán)的GEF檢測方法，適用于96孔和384孔。該測定可應(yīng)用于多種研究，例如以高通量篩選的形式表征GEF和GEF抑制劑。使用RhoGEF Exchange Assay試劑盒（BK100）來測定GEF活性，該試劑盒中含有人Cdc42, Rac1和RhoA蛋白和Dbs的GEF結(jié)構(gòu)域，作為Cdc42和RhoA的陽性對照GEF（圖1），Dbs顯示Rac1的GEF活性極低（圖2）。有趣的是，在基于FRET的實驗中，人類Dbs可以激活Rac1。

圖1. Cdc42, RhoA和 Rac1的GEF活性

圖2. 96 孔板中 Cdc42、RhoA 和 Rac1 的 Dbs 交換活性。所示數(shù)據(jù)為三次實驗的平均值。

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4、內(nèi)源性 GTPase 速率測定

GTP與GDP結(jié)合狀態(tài)的平衡，是它們從激活狀態(tài)(GTP形式)轉(zhuǎn)向非活動狀態(tài)(GDP形式)時的轉(zhuǎn)換機(jī)制的基礎(chǔ)。GTP 與 GDP 結(jié)合狀態(tài)的平衡由催化蛋白控制的，這些催化蛋白可以增加 GDP 與 GTP 的交換速率（GEFs），提高 GTP 酶的活性（GAPs），或阻止 GDP 的交換（GDIs）。最近的研究表明，GAP 蛋白家族有 70 個成員，規(guī)模龐大，在細(xì)胞從正常狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧膊顟B(tài)時發(fā)揮著重要的作用9。

細(xì)胞中的 GAP 活性可通過缺失或突變而降低，在這種情況下，GAP 所作用的小 GTP 酶處于活性 GTP 狀態(tài)的時間延長，實際上就形成了一種永jiu活性狀態(tài)。例如，Rho GTPase 控制著軸突導(dǎo)向的能力，一旦發(fā)生 Rho-GAP 的突變就會導(dǎo)致智力遲鈍；突變的 Ras-GAP（NF1 基因）已被證明可導(dǎo)致神經(jīng)纖維瘤病10；而突變的 Rheb-GAP 已被證明可導(dǎo)致結(jié)節(jié)性硬化綜合癥11。

目前已知的某些 GAP 具有 GAP 活性，其中大多數(shù)GAP 蛋白只是通過同源性才被認(rèn)為含有 GAP 活性。Cytoskeleton推出了 GAP 活性檢測試劑盒，為這一領(lǐng)域的探索提供了便利。試劑盒中的試劑經(jīng)過優(yōu)化，可使 GAP 蛋白具有高活性，這樣就可以通過簡單的吸光度檢測方法來檢測小 G 蛋白增強的 GTPase。

圖3. 通過 RhoA 和 Rac1 蛋白水解 GTP 測定 p50 RhoGAP 活性

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參考文獻(xiàn)：

1.Ridley, AJ. & Hall, A. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell 70: 389-399 (1992)

2.Ridley, AJ. et al. The small GTP-binding protein Rac regulates growth factor-induced membrane ruffling. Cell 70: 401-410 (1992)

3.Coso, OA., et al.  The small GTP-binding proteins Rac and Cdc42 regulate the activity of the JNK/SAPK signaling pathway.  Cell 81: 1137-1146 (1995)

4.Small, JV., et al. The lamellipodium: where motility begins.  Trends Cell Biol. 12: 112-120 (2002)

5.Jaffe, A, & Hall, A,  Rho GTPases in transformation and metastasis, Adv. Cancer Res. 84: 57-80 (2002)

6.Clark et al. 1993. Selective amplification of novel members of the ADF-ribosylation factor (Arf) family: cloning of new human and Drosophila ARL genes. PNAS, 90, 8952-6.

7.Chang L. et al. 2007. Rad GTPase Deficiency Leads to Cardiac Hypertrophy. Molecular Cardiology, 116: 2976-2983.

8.Herrmann, C., Martin, G.A. and Wittinghofer, J. Biol. Chem. 270: 2901 (1995)

9.Bernards A. and Settleman J. 2004. GAP control: regulating the regulators of small GTPases. Trends Cell Biol. 14, (7), 377-385.

10.Cichowski K. and Jacks T. 2001. NF1 tumor suppressor gene function: narrowing the GAP. Cell. 104, 593-604.

11.Li Y. et al. 2004. TSC2: filling the GAP in the mTOR signaling pathway. Trends Biochem. Sci. 29, 32-38.