ELISA實驗步驟

 圖3 ELISA標準實驗流程

實驗前準備：
1.   樣本采集：
a)   血漿：采集血漿時可使用EDTA、肝素或檸檬酸鹽作為抗凝血劑。采集后30分鐘內(nèi)，1000xg離心15分鐘。立即檢測或分裝后于≤-20℃儲存。避免反復(fù)凍融。
b)   細胞培養(yǎng)上清液：通過離心去除顆粒，立即檢測或分裝后將樣品于≤-20°C儲存。避免反復(fù)凍融。
c)   細胞裂解液：在裂解緩沖液中裂解細胞并將其放在冰上靜置30分鐘。14,000xg離心5分鐘除去不溶物。將上清液轉(zhuǎn)移至新管中利用總蛋白分析法定量總蛋白濃度。立即檢測或分裝后將樣品于≤-20°C儲存。
d)   乏血小板血漿：在采集血漿時可使用EDTA、肝素或檸檬酸鹽作為抗凝血劑。采集后30分鐘內(nèi)，1000xg離心15分鐘。建議在2-8°C下，10,000xg 再次離心10分鐘，以便全去除血小板。立即檢測或分裝后于≤-20°C儲存。避免反復(fù)凍融。
e)   血清：使用不含抗凝劑的收集管，讓樣品在室溫下凝結(jié)30分鐘，然后1000xg離心15分鐘。立即取出血清并進行檢測或分裝后于≤-20°C儲存。避免反復(fù)凍融。
f)   唾液：將唾液收集到管中，10,00xg離心5分鐘。收集水相，立即檢測或分裝后將樣品于≤-20°C儲存。避免反復(fù)凍融。
g)   尿液：無菌進行當天shou次尿液的采集(中段尿)，直接排入無菌容器中。離心去除不溶顆粒物質(zhì)。立即檢測或分裝后于≤-20°C儲存。避免反復(fù)凍融。
h)   母乳：2-8°C，1000xg 離心15分鐘。重復(fù)進行水相部分的收集，總共3次。立即檢測。
i)   組織勻漿液：制備方法因組織類型而異。用1XPBS緩沖液沖洗以除去多余血液，使用20mL 1XPBS進行勻漿，并于≤-20°C下儲存過夜。將勻漿液凍融兩次以便破壞細胞膜，然后5000xg離心5分鐘。去除上清液后立即進行檢測，或者分裝后于≤-20°C儲存。避免反復(fù)凍融。
j)   組織裂解液：用PBS沖洗組織，將組織切成1-2mm的薄片，用組織勻漿器在PBS中進行勻漿。加入等體積的含蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液，在室溫下裂解組織30分鐘，裂解過程中輕搖裂解液。離心去除沉淀。利用總蛋白質(zhì)分析法定量總蛋白的濃度。立即檢測或分裝后于≤-20°C儲存。
2. 預(yù)實驗
ELISA實驗中進行預(yù)實驗是非常有必要的，一方面為了檢測試劑盒是否好用，標曲擬合線性是否良好，最高OD值是否能達到2.0左右，是否存在假陽性假陰性；另外一方面為了檢測樣本最佳稀釋比例，樣本濃度過高要進行稀釋；樣本濃度過低要選擇超敏試劑盒。
3. ELISA實驗對照
a)   空白對照：提供背景信號參考，并確保讀取值表示樣品中的分析物濃度。
b)   陽性對照：已知含有目標蛋白的內(nèi)源性可溶樣品，或已知含有檢測抗體免疫原的純化蛋白或多肽來作為陽性對照。當樣品的檢測結(jié)果為陰性時，陽性對照的陽性結(jié)果可表明實驗過程無誤且有效，所以實驗的陰性結(jié)果是真實的。
c)   陰性對照：已知不表達目標蛋白的樣品。其有助于檢測非特異性結(jié)合和假陽性結(jié)果。
d)   標準品：含有已知濃度的目標蛋白的樣品，可從中獲得標準曲線。
e)   樣本基質(zhì)中的標準品（加標對照品）：加標對照可用來給出有關(guān)某種特殊樣品基質(zhì)中分析物發(fā)現(xiàn)程度的信息，從而表明檢測性能。比如，在 ELISA 中檢測血清樣品時，按照慣例標準品用正常稀釋緩沖液來稀釋。但可以同時用檢測的種屬血清來稀釋標準品。
4.實驗步驟（以Human IL-6 ELISA Kit – Quantikine，Catalog # D6050）
1. 使用前將所有試劑和樣品置于室溫。建議所有標準品、對照品和樣品一式兩份；
2.用不完的微孔板條可以移除，將它們放回含有干燥劑包裝的箔袋中，并重新密封；
3. 每孔加入100 μL檢測稀釋劑RD1W；
4. 每孔加入100 μL標準品、對照品或樣品，蓋上蓋子。室溫孵育2小時。同時做好板布局的記錄；
5. 棄去液體，使用400 μL洗滌緩沖液洗滌，重復(fù)三次，共洗滌四次。有條件的話可以使用自動洗板機，最后一次洗滌的時候，去除掉所有洗滌緩沖液后，把孔板倒置，用干凈的吸水紙吸干；
6. 每孔加人IL-6檢測抗體200 μL。蓋上蓋子，室溫孵育2小時；
7. 重復(fù)步驟5中的洗滌；
8. 每孔加底物溶液200 μL，室溫下孵育20分鐘，避光；
9. 每孔加入50 μL反應(yīng)停止液。并且能夠觀察到孔里的顏色從藍色變成黃色。如果孔內(nèi)顏色呈綠色或顏色變化不均勻，輕拍板以確保充分混合；
10. 在30分鐘內(nèi)測定每個孔的吸光度，設(shè)置酶標儀波長為450nm。如果有波長校正，請設(shè)置為540nm或570nm。如果波長校正不可用，可以用450nm讀數(shù)減去540nm或570nm讀數(shù)。

ELISA操作小技巧
 

圖4 ELISA操作小技巧（圖源于R&D）

ELISA常見問題

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參考資料：Bio-techne ELISA技術(shù)指南