T細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的衛(wèi)士，肩負(fù)著適應(yīng)性免疫的重?fù)?dān)，在細(xì)胞免疫和體液免疫都有著關(guān)鍵性的作用。不僅如此，基于T細(xì)胞的三大免疫療法：CAR-T、TCRT、TILs也在“遍地開花"。截止目前，FDA共批準(zhǔn)了6款CAR-T產(chǎn)品，中國(guó)也上市了5款CAR-T產(chǎn)品，全球共有11款CAR-T產(chǎn)品獲批！2024年2月16日，全球shou款TIL療法- lifileucel（LN-144）獲批上市，用于治療晚期黑色素瘤，成為有望攻克實(shí)體瘤的又一把利劍。
類器官與T細(xì)胞的共培養(yǎng)也是一大研究“爆點(diǎn)"：T細(xì)胞與腫瘤類器官共培養(yǎng)，可為優(yōu)化個(gè)性化實(shí)體瘤靶向細(xì)胞療法提供支持[1]，也可基于類器官免疫共培養(yǎng)技術(shù)的藥物篩選平臺(tái)，篩選出能改善腫瘤免疫原性的表觀遺傳調(diào)節(jié)藥物[2]。
不可否認(rèn)的是，這些巨大成就都依賴于T細(xì)胞的體外培養(yǎng)，那么T細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)又是如何實(shí)現(xiàn)的呢？小優(yōu)接下來(lái)會(huì)從T細(xì)胞來(lái)源---培養(yǎng)---激活---擴(kuò)增---分化---活力維持---功能檢測(cè)---熱門研究八個(gè)方面給大家介紹。
敲黑板：T細(xì)胞之外你還想了解哪些細(xì)胞？更多驚喜文末等著你~

1.T細(xì)胞來(lái)源
可來(lái)源于捐獻(xiàn)者的血液或者其他實(shí)體組織樣本，進(jìn)而通過(guò)樣本制備、細(xì)胞分選等操作獲得高純度高活性的T細(xì)胞。具體樣本制備和細(xì)胞分選的內(nèi)容，小伙伴們可以參考之前的文章：《免疫細(xì)胞培養(yǎng)通關(guān)技巧之樣本制備》和《免疫細(xì)胞培養(yǎng)通關(guān)技巧之細(xì)胞分選》。用于癌癥治療的原代T細(xì)胞通常來(lái)自自體（患者）或同種異體（非患者）供體。自體樣本是CAR-T療法等過(guò)繼細(xì)胞治療的標(biāo)準(zhǔn)做法，有助于避免在輸回患者體內(nèi)時(shí)與非自身抗原發(fā)生自身免疫反應(yīng)。在這些情況下，培養(yǎng)和擴(kuò)增工程化T細(xì)胞至關(guān)重要，因?yàn)榘┌Y患者的天然T細(xì)胞數(shù)量通常會(huì)減少。
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2.T細(xì)胞培養(yǎng)
培養(yǎng)體系
可使用經(jīng)典的培養(yǎng)體系，即基礎(chǔ)培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)T細(xì)胞常用的培養(yǎng)基是RPMI-1640）+胎牛血清或者無(wú)血清培養(yǎng)基。需要注意的是，胎牛血清作為動(dòng)物源制品，若培養(yǎng)的T細(xì)胞后續(xù)用于人類治療時(shí)則需慎重，小優(yōu)更傾向于推薦大家使用無(wú)血清的培養(yǎng)體系。
 

圖1含血清和無(wú)血清培養(yǎng)體系的區(qū)別

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培養(yǎng)條件
T細(xì)胞的培養(yǎng)溫度為37°C；CO2 濃度通常為5%；此外，也需要防止細(xì)菌、真菌、支原體、內(nèi)毒素、病毒等污染物的出現(xiàn)。這部分的內(nèi)容大家可以參考《免疫細(xì)胞培養(yǎng)通關(guān)技巧之質(zhì)量?jī)?yōu)化》。
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3.T細(xì)胞激活
自然狀態(tài)下，T細(xì)胞的激活需要兩個(gè)信號(hào)：第一個(gè)信號(hào)T細(xì)胞上的抗原特異性T細(xì)胞受體（TCR/CD3）與抗原提呈細(xì)胞（APC）上的抗原肽-MHC分子復(fù)合物的相互作用，即抗原識(shí)別過(guò)程，第一信號(hào)是T細(xì)胞活化所必須的，但不能引起T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子釋放。當(dāng)T細(xì)胞表面表達(dá)的共刺激分子與APC表達(dá)的配體相結(jié)合時(shí)，就生成了第二個(gè)T細(xì)胞激活信號(hào)，其中最重要的是T細(xì)胞表面CD28分子與APC表面相應(yīng)配體B7-1(CD80)和B7-2(CD86)的結(jié)合。而在體外培養(yǎng)T細(xì)胞時(shí)，則借助CD3和CD28抗體來(lái)模擬兩個(gè)激活信號(hào)。另外，也可以將CD3和CD28抗體偶聯(lián)磁珠或多聚體以激活T細(xì)胞，或者使用商品化的激活擴(kuò)增試劑盒。

圖2 T細(xì)胞的體內(nèi)體外激活示意圖

抗體法[3]：在體外聯(lián)合使用抗CD3和CD28的抗體刺激T細(xì)胞，抗CD3單克隆抗體識(shí)別 TCR-CD3復(fù)合體上CD3分子的ε鏈并相互作用，從而增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的活化與增殖。抗CD28單克隆抗體與B7-CD28復(fù)合體上的CD28分子相互作用，能提供有效的共刺激信號(hào)，激發(fā)T細(xì)胞增殖，可誘導(dǎo)T細(xì)胞的分化、增殖和IL-2等細(xì)胞因子的分泌。從而模擬T細(xì)胞活化的雙信號(hào)作用。
a)  使用anti-human CD3抗體（無(wú)菌PBS稀釋）包被24孔板，包被濃度1μg/mL；室溫放置4 h（也可4℃包被過(guò)夜），吸去未結(jié)合的抗體懸液；
b)  每孔加入500 μL含1%BSA的PBS溶液進(jìn)行封閉，室溫30 min，結(jié)束后用無(wú)菌PBS洗滌1次；
c)  PBMC接種于上述24孔板中，接種密度1*106/mL，培養(yǎng)體系為含10%熱滅活胎牛血清、1%雙抗、3μg/mL anti-human CD28、100 IU/mL human IL-2的RPMI-1640培養(yǎng)基；
d)  培養(yǎng)3天后，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力，用于進(jìn)一步分析。

磁珠法：以美天旎T Cell TransAct™, huma為例：在100nm右旋糖苷基質(zhì)上分別耦聯(lián)人源化的CD3、CD28抗體，高效模擬抗原遞呈過(guò)程，實(shí)現(xiàn)高效、持久的T細(xì)胞激活。使用時(shí)，按照體積比1:100加入即可。
 

圖3 不同孔板對(duì)應(yīng)的T細(xì)胞密度及所需激活試劑體積

注意事項(xiàng)：
原代T細(xì)胞一般在體外的培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)三周，用于功能實(shí)驗(yàn)的T細(xì)胞建議培養(yǎng)時(shí)間在14天以內(nèi)。
抗體法中CD3和CD28的包被濃度需要摸索確定，一般為1-10ug/ml，且多采用CD3包被，CD28游離的方法。
磁珠法中，磁珠分為微米級(jí)和納米級(jí)，以T Cell TransAct™, human（130-128-758，納米級(jí)）和T Cell Activation/Expansion Kit, human（130-091-441，微米級(jí)）為例， 130-128-758（微米級(jí)）是通過(guò)換液，或者離心清洗就可以去除，130-091-441（微米級(jí)）則通過(guò)MACSiMAG分選器去除磁珠和抗體。
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4.T細(xì)胞擴(kuò)增
T細(xì)胞擴(kuò)增使研究人員能夠生成大量T細(xì)胞，以最大限度地發(fā)揮治療潛力。通常會(huì)在培養(yǎng)物中添加特定細(xì)胞因子，例如白細(xì)胞介素2 (IL-2) 或 IL-7/IL-15，以支持T細(xì)胞擴(kuò)增和存活。21年一篇文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)：T細(xì)胞密度為2.5×105 cell/mL時(shí)的擴(kuò)增效果優(yōu)于較高或較低密度，且在高于50 IU/mL的IL-2濃度下表現(xiàn)出更高的擴(kuò)增效率[4]。當(dāng)需要大量抗原特異性T細(xì)胞時(shí)，可以反復(fù)接觸抗原以激活T細(xì)胞從而達(dá)到擴(kuò)增的目的，但是反復(fù)激活的方法應(yīng)謹(jǐn)慎使用，因?yàn)樗鼤?huì)導(dǎo)致T細(xì)胞衰竭和功能下降。在擴(kuò)增階段，可以觀察T細(xì)胞克隆團(tuán)的形成、檢測(cè)細(xì)胞增殖情況或者流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)相應(yīng)的細(xì)胞標(biāo)記物。
 

圖4 T細(xì)胞擴(kuò)增階段形成的克隆團(tuán)[5]

5.T細(xì)胞分化
不同類型的效應(yīng)T細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著核心作用，該網(wǎng)絡(luò)充當(dāng)人體的防線，并在疾病狀態(tài)下引發(fā)免疫反應(yīng)。如Th1細(xì)胞因子在識(shí)別和清除細(xì)胞內(nèi)病原體如病毒和細(xì)菌，包括結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌和利什曼原蟲方面起著重要作用；Th2細(xì)胞介導(dǎo)針對(duì)細(xì)胞外寄生蟲、細(xì)菌、過(guò)敏原和毒素免疫反應(yīng)的活化和維持；Th17細(xì)胞在宿主防御細(xì)胞外病原體中發(fā)揮作用；Treg對(duì)維持自身耐受性和免疫細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。T細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化需要添加的細(xì)胞因子或抗體大家可以參考圖5，同時(shí)小優(yōu)也給大家匯總了一份體外誘導(dǎo)T細(xì)胞分化方案（圖6）。

圖5 Na?ve T細(xì)胞在不同抗體或細(xì)胞因子作用下誘導(dǎo)分化為對(duì)應(yīng)亞型

 圖6 體外誘導(dǎo)T細(xì)胞分化方案[6]

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6.T細(xì)胞活力維持
T細(xì)胞活力對(duì)于任何T細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)或治療的成功都至關(guān)重要，在這里需要確認(rèn)三個(gè)方面的因素：避免T細(xì)胞培養(yǎng)密度過(guò)高而出現(xiàn)密度抑制的現(xiàn)象；確保培養(yǎng)體系可以提供T細(xì)胞必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子；保證培養(yǎng)環(huán)境的無(wú)菌。

7.T細(xì)胞功能檢測(cè)
一旦培養(yǎng)出足夠數(shù)量的T細(xì)胞，就可以通過(guò)各種實(shí)驗(yàn)方法來(lái)評(píng)估T細(xì)胞的表型、功能和活力，比如：
細(xì)胞毒性試驗(yàn)：測(cè)量T細(xì)胞殺死靶細(xì)胞（例如癌細(xì)胞或感染細(xì)胞）的能力。
ELISpot檢測(cè)：酶聯(lián)免疫吸附斑點(diǎn)（ELISpot)實(shí)驗(yàn)可量化特定細(xì)胞因子的分泌，從而了解T細(xì)胞的功能。
流式細(xì)胞術(shù)：可用于分析T細(xì)胞的表面標(biāo)志物、胞內(nèi)蛋白及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
 

圖7 T細(xì)胞不同亞型的表面標(biāo)記物、轉(zhuǎn)錄因子以及分泌的細(xì)胞因子

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8.T細(xì)胞熱門研究
小優(yōu)以發(fā)表在Nature Protocols的《Tumor organoid–T-cell coculture systems》中描述的腫瘤類器官與T細(xì)胞共培養(yǎng)為例給大家介紹：
類器官part：在開始共培養(yǎng)之前，需從腫瘤組織中獲取腫瘤細(xì)胞建立腫瘤類器官，在共培養(yǎng)前兩天從基質(zhì)膠中分離腫瘤類器官，共培養(yǎng)前一天用IFN-γ進(jìn)行刺激，共培養(yǎng)當(dāng)天，將腫瘤類器官解離成單細(xì)胞。
T細(xì)胞part：從外周血中分離PBMC，具體的操作方法也可以參考《免疫細(xì)胞培養(yǎng)通關(guān)技巧之樣本制備》。
共培養(yǎng)part： 將腫瘤類器官單細(xì)胞懸液與PBMC一起培養(yǎng)在涂有anti-CD28的培養(yǎng)皿中，并加入IL2和anti-PD1。共培養(yǎng)一周后，將新的腫瘤類器官解離成單細(xì)胞懸液再次刺激PBMC。共培養(yǎng)兩周后，可凍存T細(xì)胞（黃色）、評(píng)估T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)性（綠色）或進(jìn)行腫瘤類器官殺傷實(shí)驗(yàn)（藍(lán)色）。
 

圖8 腫瘤類器官- T細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)流程圖[7]

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注意事項(xiàng)：
共培養(yǎng)前使用IFN-γ刺激腫瘤類器官的目的是使后續(xù)共培養(yǎng)時(shí)抗原呈遞zui大化
共培養(yǎng)時(shí)加入anti-PD1是為了抵消IFN-γ對(duì)PD-L1的誘導(dǎo)
腫瘤類器官與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，需要精確控制免疫細(xì)胞比例及激活狀態(tài)
免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的反應(yīng)是動(dòng)態(tài)變化的，包括免疫監(jiān)視、免疫逃逸和腫瘤免疫編輯等過(guò)程，這些都需要在模型中得到有效模擬

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T細(xì)胞之外你還想了解哪些細(xì)胞？
除了免疫衛(wèi)士-T細(xì)胞，人體還有許多細(xì)胞在“賣力工作"（圖5）。人體有四大組織：神經(jīng)組織、結(jié)締組織、上皮組織、肌肉組織。每種細(xì)胞都有其存在的價(jià)值和研究的意義：神經(jīng)元活動(dòng)與情緒調(diào)節(jié)和心理健康緊密相關(guān)，研究神經(jīng)元有助于理解抑郁癥、焦慮癥等心理疾病的成因；成纖維細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用影響腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，了解這些相互作用有助于開發(fā)抗癌策略；巨噬細(xì)胞作為固有免疫的關(guān)鍵細(xì)胞，可參與炎癥、腫瘤免疫、自身免疫疾病等多種生理病理過(guò)程。

圖5 人體四大組織及對(duì)應(yīng)細(xì)胞類型

1.  Dekkers, J.F., et al., Uncovering the mode of action of engineered T cells in patient cancer organoids. Nature Biotechnology, 2022. 41(1): p. 60-69.
2.  Zhou, Z., et al., A T Cell‐Engaging Tumor Organoid Platform for Pancreatic Cancer Immunotherapy. Advanced Science, 2023. 10(23).
3.  Soltantoye, T., et al., Soluble and Immobilized Anti-CD3/28 Distinctively Expand and Differentiate Primary Human T Cells: An Implication for Adoptive T Cell Therapy. Iranian Journal of Allergy, Asthma and Immunology, 2022.
4.  Ghaffari, S., et al., Optimizing interleukin-2 concentration, seeding density and bead-to-cell ratio of T-cell expansion for adoptive immunotherapy. BMC Immunology, 2021. 22(1).
5.  Zhang, D.K.Y., A.S. Cheung, and D.J. Mooney, Activation and expansion of human T cells using artificial antigen-presenting cell scaffolds. Nature Protocols, 2020. 15(3): p. 773-798.
6.  Sekiya, T. and A. Yoshimura, In Vitro Th Differentiation Protocol, in TGF-β Signaling. 2016. p. 183-191.
7.  Cattaneo, C.M., et al., Tumor organoid–T-cell coculture systems. Nature Protocols, 2019. 15(1): p. 15-39.
  

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