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介紹PCR儀的兩種定量方法
閱讀：1497 發(fā)布時(shí)間：2022-11-11
將熒光基團(tuán)加入到PCR反應(yīng)體系中，通過(guò)不斷累積熒光信號(hào)從而使對(duì)PCR全程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)實(shí)現(xiàn)，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量分析未知模板的方法，即是熒光定量PCR技術(shù)。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，實(shí)時(shí)檢測(cè)全程PCR擴(kuò)增過(guò)程，按照反應(yīng)時(shí)間和熒光信號(hào)的變化能夠?qū)⒁粭l曲線(xiàn)繪制成。
定量方法
在實(shí)時(shí)熒光PCR中，模板的定量包括相對(duì)定量和定量2種方法。相對(duì)定量是指在一定樣品中靶序列相對(duì)于另一參照序列的量的變化。定量通常根據(jù)已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)使我們所感興趣基因的拷貝數(shù)確定。
1.相對(duì)定量法
相對(duì)定量法又分為比較Ct值的相對(duì)定量法和比較標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的相對(duì)定量法兩種方法。
?。?）比較Ct值的相對(duì)定量法
該方法是同時(shí)擴(kuò)增待測(cè)靶基因片段和內(nèi)參照基因片段，擴(kuò)增反應(yīng)既能夠在兩個(gè)反應(yīng)管中也能夠在一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行，并且通過(guò)兩者的ct值的差來(lái)測(cè)量。在采用此方法過(guò)程中，相對(duì)量的計(jì)算需要用到數(shù)學(xué)公式。靶基因和內(nèi)源控制物的擴(kuò)增效率大體上相同是該方法的前提。因此應(yīng)用過(guò)程中效率的偏移會(huì)或多或少影響實(shí)際拷貝數(shù)的估計(jì)。所以，反應(yīng)體系的優(yōu)化的加強(qiáng)是目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相等的保障。
（2）比較標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的相對(duì)定量法
相對(duì)定量法指的是在一定樣本中，靶序列相對(duì)于另一參照樣本量變化情況進(jìn)行分析的方法，在使用該方法過(guò)程中，參照物必須準(zhǔn)備，因此定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制比較容易，只要確定了標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度就能夠進(jìn)行對(duì)比分析。
2.定量
定量是通過(guò)已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)推算出未知樣本的量的方法。該方法，需要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度情況進(jìn)行明確，再將標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋。分為幾個(gè)不同梯度濃度然后進(jìn)行反應(yīng)測(cè)試。縱坐標(biāo)為測(cè)得的Ct值，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值，從而將標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制出來(lái)，基于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，在對(duì)未知樣品定量分析的過(guò)程中樣起始拷貝數(shù)能夠通過(guò)ct值被推算出來(lái)。