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大腸桿菌蛋白表達感受態(tài)細胞的制備

閱讀:614      發(fā)布時間:2022-5-6
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大腸桿菌蛋白表達系統(tǒng)是目前應用*泛,也是實惠的蛋白表達系統(tǒng)。E. coli具有遺傳背景清楚、細胞增殖快、表達量高、穩(wěn)定性好和抗污染能力強等特點,適用于多種屬蛋白的表達。本文主要講述了大腸桿菌蛋白表達實驗中感受態(tài)細胞制備實驗流程和原理。

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01
感受態(tài)細胞的概念

COMPETENT
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感受態(tài),是指宿主細胞最容易接受外源基因并實現(xiàn)將其轉化的一種生理狀態(tài),它是由受體菌的遺傳性狀所決定的,同時也受菌齡以及外界環(huán)境因子的影響, 比如Ca2+就可以大大促進轉化的作用。細胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對數(shù)生長期,新鮮幼嫩的細胞是制備感受態(tài)細胞和進行成功轉化的關鍵。

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02
感受態(tài)細胞制備的原理

制備感受態(tài)細胞的方法是用預冷的CaCl2處理對數(shù)生長期的細菌,即用低滲CaCl2溶液在低溫(0℃)時處理快速生長(進入對數(shù)生長期)的細菌,從而獲得感受態(tài)細胞。此時細胞膨脹成球形,外源DNA分子在低溫條件下易形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附在細胞表面,通過熱激處理促進細胞對外源DNA分子的吸收。轉化效率非常高。此方法的關鍵在于選用的細胞必須處于對數(shù)生長期,實驗操作必須在低溫無菌環(huán)境下進行。



03
大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備實驗


01
實驗儀器及試劑
  • 儀器:超凈工作臺,搖床,高壓滅菌鍋,培養(yǎng)箱,制冰機,超低溫冰箱,離心機,接種環(huán),試管,搖瓶(2L),平板,移液槍,槍頭,離心管(500mL),EP管(1.5mL),藍蓋瓶,泡沫箱

  • 試劑:CaCl2溶液:PIPES 1.51g,CaCl2•2H2O 4.41g,甘油 75ml,pH=7.0,定容至500ml。

LB培養(yǎng)基(固體、液體):Tryptone 1.00g,Yeast 0.50g,NaCl 1.00g,定容至100ml。(固體培養(yǎng)基加入1.5%的瓊脂)

抗性:卡那霉素,氨卞青霉素,氯霉素,四環(huán)素。

  • 材料:感受態(tài)菌株


02
實驗方法及操作步驟
  • 取-80℃凍存的感受態(tài)菌株,用接種環(huán)劃線分離接種于固體平板上(平板抗性根據(jù)感受態(tài)選擇),做好標記,倒置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。
  • 第二天,從平板上挑取單個菌落,接種至含有4ml LB培養(yǎng)液(抗性根據(jù)感受態(tài)選擇)的試管中,37℃,195rpm,震蕩培養(yǎng)過夜。次日取菌液4ml接種至含有400ml LB培養(yǎng)基(抗性根據(jù)感受態(tài)選擇)的2L搖瓶中,37℃,200rpm震蕩培養(yǎng)約2-3小時。
  • 當菌落OD600nm值達到0.3-0.5時,將搖瓶取出放置于冰上10-15min。在無菌條件下把菌液倒入500ml的預冷的離心管中,離心4℃,3000r,8min。
  • 棄去上清,加入約200ml的預冷的CaCl2溶液,吹打混勻,懸浮菌體,放入冰浴30min。
  • 離心4℃,3000r,8min,棄去上清,加入約8ml預冷的CaCl2溶液,重新懸浮菌體。
  • 將用CaCl2溶液處理后的菌體分裝于1.5ml的EP管中,每管110ul,保存于-80℃的超低溫冰箱中。



04
感受態(tài)細胞測試

隨機取1支本次制備的感受態(tài)細胞,轉化一個以前轉化成功的質粒,從轉化平板上的菌落數(shù)及表達鑒定的SDS-PAGE電泳圖(看是否出現(xiàn)其他的雜帶及蛋白表達情況)判斷感受態(tài)的效價。如果效價好,這批感受可以用;否則,要重新制備。


注意事項

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1、每次取感受態(tài)細胞時,注意查看庫存,保證庫存不低于15支,少于15支時要及時制備。
1、菌株生長在對數(shù)時進行CaCl2處理。
2、全程操作要【低溫無菌】。
3、用CaCl2溶液懸浮菌體時要均勻,不要有塊狀。
4、常用感受態(tài)細胞的選擇抗性:BL21(DE3)無抗性;BL21 Codon plus(DE3)具有氯霉素抗性;OrigamiB(DE3)具有卡那霉素抗性,不能用于具有卡那霉素抗性質粒的表達;BL21(DE3)plysS具有氯霉素抗性;Rosetta(DE3)具有氯霉素抗性;Shuffle具有鏈霉素抗性或不用抗性。


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