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人外周血TH1/TH2/TH17流式抗體配色方案
閱讀：7310發(fā)布時間：2017-11-17
人外周血TH1/TH2/TH17染色
注意：采集外周血的抗凝管必須是肝素抗凝管，刺激劑盡量選用凍干粉自己配置；cocktail刺激劑是液體形式，PMA會因保存不當(dāng)導(dǎo)致活性降低，影響刺激效果，而凍干粉形式的PMA較穩(wěn)定，可以保證刺激效果。
人外周血TH1/TH2/TH17染色/流式檢測方法
細(xì)胞刺激步驟：（刺激體系1ml）
取人外周血（肝素抗凝）200 ml加入24孔板內(nèi)，加入800 ml的*培養(yǎng)基，再加入1ml PMA(25ug/ml)、1μl Ionomycin（1mg/ml），輕輕吹打混勻細(xì)胞。放入 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)刺激0.5小時后，每孔再加入2μl Brefeldin A（5mg/ml），輕輕吹打混勻細(xì)胞，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)刺激3.5小時。
流式檢測步驟：
1、收集細(xì)胞于流式管內(nèi)，500 g/8min離心，槍頭吸去上清，彈散管底沉淀，加入相應(yīng)的表面染色抗體（CD3\CD8），彈散混勻。室溫避光孵育15分鐘后，500 g/8min離心，槍頭吸去上清；
2、彈散管底沉淀，加入1ml的固定/破膜工作液，（1ml Fixation/Permeabilization Concentrate加入3ml Fixation/Permeabilization Diluent稀釋），旋渦混勻,現(xiàn)配現(xiàn)用；
3、室溫避光孵育30分鐘， 600 g/10min離心，在吸水紙上倒扣流式管棄去上清（此時細(xì)胞已在管底形成很牢固的沉淀，不容易丟 失），彈散管底沉淀；
4、加入1ml Permeabilization Buffer(此為10X，須與蒸餾水1：10稀釋成工作液)工作液離心洗滌細(xì)胞，破膜15分鐘（室溫避光）， 600 g/10min，在吸水紙上倒扣流式管棄去上清，彈散管底沉淀；
5、加入100μl Permeabilization Buffer（1x），同時加入相應(yīng)的細(xì)胞因子染色抗體，室溫避光孵育15分鐘；
6、加1ml Permeabilization Buffer（1x），600 g/ 8min；在吸水紙上倒扣流式管棄去上清；彈散管底沉淀；
7、加入適量體積（建議300~500 ml）的PBS重懸細(xì)胞，并上機檢測并分析。
注意：1、根據(jù)實驗需求選擇相應(yīng)的抗體，并做單染管用于調(diào)節(jié)補償（具體如何設(shè)置單染管，可參照Biogems流式手冊補償章節(jié)介紹）。
2、盡量做同型對照，因細(xì)胞因子表達(dá)量不高（尤其是IL-4表達(dá)量非常低），細(xì)胞因子抗體對應(yīng)的同型對照一般都要做。
3、PMA刺激會導(dǎo)致人T細(xì)胞表面CD4表達(dá)的下調(diào)，PMA與Lonomycin聯(lián)合刺激下調(diào)非常明顯，4h刺激后會下調(diào)50%以上，6h刺激幾乎檢測不到CD4，因此我們的界定CD4+T細(xì)胞是通過染CD3和CD8，來圈CD3+CD8-的細(xì)胞。
4、PMA對小鼠T細(xì)胞CD4表達(dá)影響很小，因此可以直接染CD4來圈門。
5、因破膜劑對細(xì)胞損傷較大，建議離心后形成的細(xì)胞沉淀先彈散形成細(xì)胞懸液，在加入破膜劑，這樣會減少對細(xì)胞的損傷（形成的細(xì)胞碎片較少）。
人外周血TH1/TH17染色結(jié)果
注意：細(xì)胞破膜后對形態(tài)影響較小，因此可以直接圈淋巴門分析，在通過圈CD3+CD8-的細(xì)胞（此處未列出圖）來分析CD4+的細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的量。因此此圖橫坐標(biāo)就直接標(biāo)的CD4。
人TH1/TH2/TH17染色所需抗體及輔助試劑
品牌 | 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 價格 |
BioGems | 05111-60 | Anti-Human CD3 PE | 25 test/100 tests | 700元/ |
BioGems | 10111-50 | Anti-Human CD8a FITC | 25 test/100 tests | 560元/ |
BioGems | 80811-80 | Anti-Human IFN gamma APC | 25 test/100 tests | 1680元/ |
BioGems | 81111-77 | Anti-Human IL-4 PE-Cy7 | 25 test/100 tests | 1890元 |
BioGems | 73821-60 | Anti-Human IL-17A PE | 25 test/100 tests | 1890元 |
BioGems | 44212-80-100 | Mouse IgG1 Isotype Control APC | 100 mg | 1750元 |
BioGems | 44212-77-100 | Mouse IgG1 Isotype Control PE-Cy7 | 100 mg | 1890元 |
BioGems | 44212-60-100 | Mouse IgG1 Isotype Control PE | 100 mg | 1890元 |
BioGems | 2031560-5mg | Brefeldin A | 5 mg | 880元 |
BioGems | 5608212-1mg | Ionomycin (calcium salt) | 1 mg | 880元 |
BioGems | 1652981-1mg | Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA | 1 mg | 880元 |
BioGems | 92110-00-150 | Permeabilization Buffer (10X) | 150 ml | 1030元 |
BioGems | 92160-00-160 | Transcription Factor Fixation/Permeabilization Diluent | 160 ml | 420元 |
BioGems | 92550-00-50 | Transcription Factor Fixation/Permeabilizatio Concentrate | 50 ml | 1050元 |
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| 總價 | 17390元 |
方案提供：Biogems*。Biogems是PeproTech的流式抗體品牌，優(yōu)勢是基于優(yōu)異品質(zhì)的較低價位，現(xiàn)正進(jìn)行一系列*活動。
TH1/TH2/TH17流式抗體檢測配色方案產(chǎn)品由重慶市華雅干細(xì)胞技術(shù)有限公司授權(quán)代理，：
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