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ProteanFect貼壁細胞轉(zhuǎn)染攻略|LX2轉(zhuǎn)染操作protocol
閱讀：61發(fā)布時間：2025-3-3
ProteanFect 轉(zhuǎn)染試劑盒是全·球首·款自組裝蛋白納米顆粒核酸轉(zhuǎn)染試劑，專為難轉(zhuǎn)細胞系設(shè)計，能夠?qū)崿F(xiàn)卓·越的外源基因遞送與表達。作為一種非病毒、非電轉(zhuǎn)、非脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑，ProteanFect可高效、低毒、簡便地將基因遞送至細胞中，尤其適用于大片段和多片段基因遞送。LX2細胞是一種人類肝星狀細胞的永生化細胞系，廣泛用于研究肝纖維化、肝損傷、肝臟疾病模型以及藥物篩選。LX2貼壁生長，呈上皮細胞樣。本文將詳細介紹如何使用ProteanFect轉(zhuǎn)染試劑盒實現(xiàn)LX2細胞的高效轉(zhuǎn)染。
LX2細胞的培養(yǎng)
生長培養(yǎng)基成分：DMEM培養(yǎng)基，含10% 胎牛血清和1%雙抗。
使用ProteanFect試劑盒轉(zhuǎn)染LX2細胞
適合轉(zhuǎn)染的核酸類型：包括mRNA、siRNA和DNA。
適合轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基：使用Opti-MEM培養(yǎng)基（或無血清DMEM培養(yǎng)基）進行轉(zhuǎn)染。提前預(yù)熱或恢復(fù)至室溫。
配置ProteanFect轉(zhuǎn)染體系：具體詳見表1-3。轉(zhuǎn)染體系在配置過程中出現(xiàn)粘稠現(xiàn)象屬于正常。
細胞準備：確保細胞處于良好生長狀態(tài)，活率需超過90%。調(diào)整細胞轉(zhuǎn)染密度時，避免反復(fù)離心，以免延長處理時間，影響細胞活力和轉(zhuǎn)染效率。
細胞轉(zhuǎn)染：對于貼壁細胞，可消化成細胞懸液進行懸浮轉(zhuǎn)染，也可提前種板進行貼壁轉(zhuǎn)染。具體詳見表1。孵育時間建議保持在45-60分鐘，延長時間可能影響細胞活力。
轉(zhuǎn)染效率與細胞活率檢測：使用陽性對照mRNA時，可在轉(zhuǎn)染后5-48小時內(nèi)觀察EGFP的表達。細胞活率可通過鏡下觀察、臺盼藍染色或流式細胞術(shù)等方法檢測，若細胞狀態(tài)良好，鏡下觀察可見細胞呈現(xiàn)抱團生長狀態(tài)。
a.ProteanFect轉(zhuǎn)染體系在配置過程中可能會出現(xiàn)一定的粘稠現(xiàn)象，屬于正常情況。
b.孵育時間可根據(jù)不同細胞類型有所調(diào)整，建議孵育時間不超過2小時。
c.使用陽性對照mRNA時，可在轉(zhuǎn)染后5-48小時內(nèi)觀察到EGFP的表達。
a.建議mRNA濃度≥1 μg/μL。如需同時轉(zhuǎn)染多個mRNA，為確保在轉(zhuǎn)染多個mRNA時保持高效的轉(zhuǎn)染效果，加入的mRNA總量為0.5 µg。
b.建議siRNA濃度≥20 μM。如需同時轉(zhuǎn)染多個siRNA，為確保在轉(zhuǎn)染多個siRNA時保持高效的轉(zhuǎn)染效果，加入的siRNA總量為40 pmol。
c.建議DNA濃度≥0.5 µg/µL；如需同時轉(zhuǎn)染多個DNA，為確保在轉(zhuǎn)染多個DNA時保持高效的轉(zhuǎn)染效果，加入的DNA總量不超過0.4 µg。同時，轉(zhuǎn)染效率受DNA質(zhì)量影響，建議使用無內(nèi)毒素試劑盒制備DNA，并確保OD值在1.7-1.9之間。使用無核酸酶純水將DNA稀釋至0.5-2 µg/µL的濃度，以提高轉(zhuǎn)染效果并降低細胞毒性。
使用ProteanFect試劑盒轉(zhuǎn)染LX2細胞實例
（1） 轉(zhuǎn)染步驟
（2） 結(jié)果分析
在轉(zhuǎn)染 EGFP mRNA或GFP pDNA后，可通過熒光顯微鏡和流式細胞術(shù)對細胞轉(zhuǎn)染后的細胞活力與轉(zhuǎn)染效率進行分析。首先通過熒光顯微鏡對轉(zhuǎn)染后LX2細胞的EGFP蛋白質(zhì)表達、細胞形態(tài)和活力進行定性評估（圖 1）。同時，收集轉(zhuǎn)染后的細胞進行流式檢測以定量分析其轉(zhuǎn)染效率。細胞收集完成后，離心棄去培養(yǎng)基，用1 × DPBS重懸細胞，進行流式檢測（圖2，圖3）。
圖1. 利用ProteanFect貼壁轉(zhuǎn)染LX2細胞，EGFP mRNA轉(zhuǎn)染后24小時和GFP pDNA轉(zhuǎn)染后48小時的表達熒光圖。
圖2. 利用ProteanFect貼壁轉(zhuǎn)染LX2細胞，EGFP mRNA轉(zhuǎn)染后24小時和GFP pDNA轉(zhuǎn)染后48小時的表達流式分析圖。
圖3. 利用ProteanFect懸浮轉(zhuǎn)染LX2細胞，EGFP mRNA轉(zhuǎn)染后24小時和GFP pDNA轉(zhuǎn)染后48小時的表達流式分析圖。
常見問題
1. 如何提升轉(zhuǎn)染效率
延長轉(zhuǎn)染時間：根據(jù)細胞狀態(tài)適當延長轉(zhuǎn)染時間，通常不超過2小時。
2. 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染要求
轉(zhuǎn)染效率受DNA質(zhì)量影響。建議使用無內(nèi)毒素試劑盒制備DNA，并確保OD值在1.7-1.9之間；使用無核酸酶純水將DNA稀釋至0.5-2 µg/µL的濃度。
3. 細胞系轉(zhuǎn)染前處理
1）為獲得良好的轉(zhuǎn)染效率，建議使用活性超過90%的細胞，可以通過臺盼藍染色測定細胞活性。2）不建議使用傳代次數(shù)超過15次的細胞進行實驗。3）新復(fù)蘇的細胞在轉(zhuǎn)染實驗前需傳代2-3次，待細胞恢復(fù)正常生長后使用。
4. 關(guān)于試劑盒中陽性對照的使用建議
首·次嘗試時，建議設(shè)置陽性對照組（EGFP mRNA和GFP pDNA），以檢測實驗操作和試劑的有效性。使用96孔板的細胞量即可，節(jié)省細胞和試劑。
5. 轉(zhuǎn)染時的細胞數(shù)范圍
說明書中提供了最佳轉(zhuǎn)染條件下的細胞數(shù)量范圍，但在特殊情況下，如細胞較大，可根據(jù)細胞大小降低細胞數(shù)以匹配相應(yīng)培養(yǎng)皿。如果細胞數(shù)量較少，也可以進行轉(zhuǎn)染。以96孔板為例，建議細胞數(shù)量不低于4×103/孔，以確保后續(xù)檢測的可靠性。
6. 轉(zhuǎn)染后細胞狀態(tài)與活力
轉(zhuǎn)染后，細胞狀態(tài)可能與未處理組略有差異。但使用ProteanFect試劑進行轉(zhuǎn)染時，對細胞活力的損傷較小。通常在轉(zhuǎn)染后第二天，細胞狀態(tài)會基本恢復(fù)。
7. 轉(zhuǎn)染后細胞離心后看不到沉淀
對于小體積轉(zhuǎn)染體系（如96孔板），離心后細胞沉淀不明顯是正?，F(xiàn)象。細胞沉淀可能散落在離心管側(cè)壁，不影響后續(xù)結(jié)果。為減少細胞損失，離心后移液時應(yīng)避免槍頭緊貼底部。
8. 轉(zhuǎn)染體系擴大是否影響轉(zhuǎn)染效率
如轉(zhuǎn)染細胞量較大，推薦使用離心管進行孵育，轉(zhuǎn)染體系參照表3，不會影響轉(zhuǎn)染效率。
ProteanFect試劑盒類型及適用細胞系
現(xiàn)有的六款轉(zhuǎn)染試劑盒：
1. PT01--ProteanFect 轉(zhuǎn)染試劑盒
2. PT02--ProteanFect Max轉(zhuǎn)染試劑盒
3. PT03--ProteanFect Max小鼠原代免疫細胞轉(zhuǎn)染試劑盒
4. PT04--ProteanFect CRISPR Cas9基因編輯轉(zhuǎn)染試劑盒
5. PT05--ProteanFect CRISPRMax Cas9基因編輯轉(zhuǎn)染試劑盒
6. PT06-ProteanFect CRISPRMax Cas9小鼠原代免疫細胞基因編輯轉(zhuǎn)染試劑盒
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