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2020-1-9 閱讀(3211)
PCR技術(shù)從1983年開始依次經(jīng)歷普通PCR，Real-Time PCR和dPCR，現(xiàn)如今dPCR技術(shù)的發(fā)展就像1990年代末的Real-Time PCR發(fā)展一樣，發(fā)展迅猛。
下面我們以DdPCR為例，討論dPCR技術(shù)。
什么是DdPCR? 有什么技術(shù)特征？有哪些方面的應(yīng)用？
DdPCR全稱Droplet Digital PCR，引用bio-rad的描述為Droplet Digital PCR technology is a digital PCR method utilizing a water-oil emulsion droplet system. Droplets are formed in a water-oil emulsion to form the partitions that separate the template DNA molecules. The droplets serve essentially the same function as individual test tubes or wells in a plate in which the PCR reaction takes place, albeit in a much smaller format. The massive sample partitioning is a key aspect of the ddPCR technique.
從基本原理我們不難看出，DdPCR大的優(yōu)點是定量，表現(xiàn)為：
DdPCR技術(shù)有很多方面的應(yīng)用，我們按照發(fā)表文章的領(lǐng)域，可以簡單劃分為：
結(jié)合腫瘤領(lǐng)域，我們一般與之相關(guān)的有4個領(lǐng)域的應(yīng)用：
同樣的，科佰生物也針對這4個應(yīng)用開發(fā)對應(yīng)的檢測試劑盒，配套科佰生物的參考品，對試劑盒做性能評價，如下我們以EGFR T790M為例：
實驗一：靈敏度測試
待測樣本：不同%AF的EGFR T790M的標(biāo)準(zhǔn)品，依次為5%，2%，1%，0.5%，0.2%，0.1%。
首先我們選擇50%的EGFR T790M標(biāo)準(zhǔn)品(CBP10402)，該標(biāo)準(zhǔn)品是通過基因編輯，二等位基因，CN=2，編輯一條為mutation，一條為WT，經(jīng)過理論值計算、Sanger測序、Bio-Rad DdPCR試劑盒（Assay ID: dHsaCP2000019）共同驗證，確認(rèn)為50%的頻率。然后使用對應(yīng)的host cell的gDNA，按照質(zhì)量比（Qubit 3.0 三次定量取平均）有限稀釋到5%，2%，1%，0.5%，0.2%，0.1%，每個樣本準(zhǔn)備3個重復(fù)，合計18個樣本同一次實驗檢測對應(yīng)的頻率。
對應(yīng)的數(shù)據(jù)為：
由以上數(shù)據(jù)可見，EGFR T790M檢測體系，對于0.1%都是能檢出，且符合標(biāo)準(zhǔn)，但是波動比較大。另外實驗過程中，我們發(fā)現(xiàn)雖然DdPCR理論上可以生成20000個液滴，但是多次實驗表明，實際生成往往是低于這個數(shù)值，平均約為8000-10000個，液滴數(shù)越少，因此低于0.1%的頻率可能會波動很大，影響真實值判斷。
實驗二：重復(fù)性測試
待測樣本：取1%和0.1%的EGFR T790M的標(biāo)準(zhǔn)品，分成8份，每份上樣10ng，一次實驗完成對應(yīng)的定標(biāo)。
對應(yīng)的數(shù)據(jù)為：
由以上數(shù)據(jù)可見，EGFR T790M檢測體系是穩(wěn)定可重復(fù)的，全部能檢出。
同樣的我們也對Gene Expression(mRNA)、CNV和Fusion開發(fā)了部分DdPCR試劑盒，利用科佰*的標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)品，我們做了性能評價，陸續(xù)上線了多款產(chǎn)品，如下是我們已經(jīng)上線的DdPCR探針、引物的清單，全部在QX200上驗證過：
更多的DdPCR產(chǎn)品可以選擇科佰生物開發(fā)定制，我們不僅可以開發(fā)定制探針、引物，我們還有標(biāo)準(zhǔn)品用于驗證體系性能評價。
