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關(guān)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染,你知道多少

2018-1-29  閱讀(5594)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染定義:將外源分子如DNA RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染:外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中,因此一個(gè)宿主細(xì)胞可存在多個(gè)拷貝數(shù),產(chǎn)生高水平的表達(dá),但通常只持續(xù)幾天,多用于啟動(dòng)子和其他調(diào)控元件的分析。一般來說,超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高,在轉(zhuǎn)染后24-72h內(nèi)分析結(jié)果,常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白,β半乳糖苷酶等來幫助檢測。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染:外源DNA既可以整合到宿主染色體中,也可能作為一種游離體存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小,通常需要一些選擇性標(biāo)記反復(fù)篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。

方法及特點(diǎn):

化學(xué)法:磷酸鈣法、DEAE-右旋糖苷法、陽離子脂質(zhì)體法

物理法:電穿孔法、顯微注射法、biolistic顆粒傳遞法

病毒介導(dǎo)法:逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒

陽離子脂質(zhì)體法:帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞。過程如下圖:

特點(diǎn):簡單通用,適用性廣,轉(zhuǎn)染效率高,重復(fù)性好,但轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清,轉(zhuǎn)染效率隨細(xì)胞類型變化大。

脂質(zhì)體法由于脂質(zhì)體復(fù)合物與貼壁細(xì)胞的接觸機(jī)會(huì)遠(yuǎn)大于懸浮細(xì)胞,所以貼壁比懸浮轉(zhuǎn)染效率要高。懸浮細(xì)胞建議使用電穿孔法。

電穿孔法:利用高壓電脈沖對(duì)細(xì)胞膜的干擾,使其形成利于核酸進(jìn)入的微孔。

特點(diǎn):需要特定儀器,適用性廣,除了質(zhì)粒外,還可轉(zhuǎn)染大的基因組,細(xì)胞致死率高。

逆轉(zhuǎn)錄病毒(RNA):通過病毒中膜糖蛋白和宿主細(xì)胞表面的受體相互作用進(jìn)入宿主細(xì)胞,之后反轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)合成DNA并隨機(jī)整合到宿主基因組中。

特點(diǎn):穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞,體內(nèi)細(xì)胞等,但攜帶基因不能太大。

腺病毒(雙鏈DNA):先和細(xì)胞表面的受體結(jié)合,繼而在αV整合素介導(dǎo)下被細(xì)胞內(nèi)吞。

特點(diǎn):可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

                                                              

 轉(zhuǎn)染步驟:DAY-1  鋪板

                 DAY 0  DNA分子與復(fù)合物混合,轉(zhuǎn)染細(xì)胞

                 After  監(jiān)測轉(zhuǎn)染水平                                                                       

影響轉(zhuǎn)染的因素:

1、血清  血清影響復(fù)合物的形成,降低轉(zhuǎn)染效率

陽離子脂質(zhì)體和DNA的*量在使用血清時(shí)會(huì)有所不同,因此想在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清時(shí)要進(jìn)行條件優(yōu)化。大部分細(xì)胞可以在無血清培養(yǎng)基中幾個(gè)小時(shí)內(nèi)保持健康,對(duì)于對(duì)血清缺乏比較敏感的細(xì)胞,可以使用OPTI-MEM I培養(yǎng)基。對(duì)于對(duì)血清缺乏比較敏感的貼壁細(xì)胞,建議使用LIPOFECTAMINE 2000

2、抗生素  比如青霉素和鏈霉素,是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對(duì)于真核細(xì)胞無毒,但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性,使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。

3、細(xì)胞代數(shù)  轉(zhuǎn)染前細(xì)胞經(jīng)過1-2次傳代保證細(xì)胞生長旺盛容易轉(zhuǎn)染,注意貼壁細(xì)胞一旦長滿就不好轉(zhuǎn)染。

4、細(xì)胞鋪板密度  一般轉(zhuǎn)染時(shí),貼壁細(xì)胞密度為70%-90%,懸浮細(xì)胞密度為2*10^6--4*10^6細(xì)胞/ml時(shí)效果較好。確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒有長滿或處于靜止期。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。

5、DNA質(zhì)量  DNA質(zhì)量對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響非常大。一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)基于電荷吸引原理,如果DNA不純,如帶少量的鹽離子,蛋白,代謝物污染都會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成和轉(zhuǎn)染的進(jìn)行。



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