RPMI Medium 1640（含雙抗） 培養(yǎng)基

RPMI Medium 1640由GIBCO干粉配制，過濾滅菌。含雙抗、HEPES。保存期長，緩沖能力強。
細胞培養(yǎng)基既是培養(yǎng)細胞中供給細胞營養(yǎng)和促使細胞生殖增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是培養(yǎng)細胞生長和繁殖的生存環(huán)境。
索萊寶公司生產(chǎn)的培養(yǎng)基精選進口干粉，用超純?nèi)ルx子水配制，0.1um過濾而成，含雙抗，含Hepes。

RPMI Medium 1640（含雙抗） 培養(yǎng)基

平時研究用的細胞，有需要冷凍保存。冷凍的過程稱為凍存，把凍上的細胞化開的過程叫細胞復蘇。細胞復蘇是一簡單的試驗操作，但操作中有許多需要注意的事項，在實驗操作中注意細小問題，才能使復蘇后的細胞狀態(tài)保持良好。

細胞復蘇實驗準備：

主要器材：一次性滴管、打火機、酒精燈、大鑷子、中鑷子、記號筆、廢液缸、封口膜、剪子。

主要試劑： PBS、培養(yǎng)液、消化酶（胰酶）、75%酒精、雙抗。

PBS配制：NaCL :4g   KCL:0.1g   Na2HPO4 :1.745g   KH2PO4 :0.1g

三蒸水： 500mL，溶解后高壓滅菌。

培養(yǎng)基配制：5mL雙抗、50mL血清，加入培養(yǎng)基中。

細胞復蘇操作步驟：

1.佩戴眼鏡和手套，從液氮罐中取出安瓿或冷凍管。

2.迅速放入38℃水浴中，并不時搖動，在1分鐘內(nèi)使其*融化，然后在無菌下取出細胞。

3.在1000r/min速度下離心5～10分鐘，棄去上層液，加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中，接種濃度1×109/L，置37℃溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長情況。若細胞密度較高，及時傳代?；驘o需離心直接將細胞加入瓶中，并加入培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)12～24小時后，充去上清，換入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

細胞復蘇的注意事項：

1.細胞復蘇時要注意融化凍存細胞的應(yīng)注意融化凍存細胞速度要快，可不時搖動安瓿或冷凍管，使之盡快通過易受損的溫度段(-5～0℃)。

2.凍存液對細胞有毒性，解凍后必須用Dhanks洗兩遍才能移入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。培養(yǎng)液中血清不能太少。

3.從液氮拿出來，以快速度丟入37度水浴，等細胞液剛剛化完取出，加培養(yǎng)液稀釋。這樣可以避免復蘇過程中細胞液中有冰晶的出現(xiàn)，冰晶會破壞細胞膜及細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的。

4.剛復蘇的細胞還是少折騰它好，細胞37°快速解凍后直接放入預熱的培養(yǎng)基。

5.DMSO在4度以下對細胞無毒，4度以上有毒；復蘇必須盡快除去。要記得慢凍速溶！

6.取細胞的過程中注意帶好防凍手套，護目鏡。細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。

7.常溫下二甲基亞砜（DMSO）對細胞的毒副作用較大，因此，必須在1-2 min內(nèi)使凍存液*融化。如果復蘇溫度太低，會造成細胞的損傷，所以選擇40℃復蘇。8.貼壁細胞復蘇實驗標準流程是將解凍后的細胞懸液行離心，以去除冷凍保護液DMSO對細胞的損傷，但是離心也會對剛復蘇的狀態(tài)欠佳的細胞產(chǎn)生損傷。也有的實驗操作是將解凍后的細胞懸液先直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，第二天換液。這可能使培養(yǎng)基中少量的DMSO對細胞造成損傷。

細胞復蘇后貼壁細胞較少的原意有哪些：

1.凍存細胞的時候是不是消化時間過長，這是一般人注意不到的地方，要知道太長的消化時間會使細胞復蘇時失去貼壁能力。

2.有可能是細胞凍存液的質(zhì)量，細胞凍存液的質(zhì)量不好也會導致細胞死亡。

3.凍存液的量加的是不是太多，ATCC推薦是不超過7%，大于5%，太多也不好。

4.凍存的時候是不是把DMSO混均勻，這個有一些影響，但不算太大。

5.凍存時溫度梯度是不是把握嚴格，很多人容易忘卻這個事情，因為這個東西流程長。

相關(guān)文獻：

 《c-Myc induced upregulation of long non-coding RNA SNHG16 enhances progression and carcinogenesis in oral squamous cell carcinoma》 作者:Shangfeng Li, Shengkai Zhang， Jie Chen 期刊:Cancer gene therapy 影響因子:4.681 PMID:30607006
《Suberoylanilide hydroxamic acid inhibits proliferation and promotes apoptosis of mouse myeloma Sp2/0 cells through activating p53/caspase-3 signaling》 作者:Yanliang Bai, Lei Huo, Chenyu Zhang, Mingyue Shi, Na Fang, Shaoping Ji, Kai Sun 期刊:INTERNATIONAL JOURNAL OF CLINICAL AND EXPERIMENTAL MEDICINE 影響因子:1.875 PMID:
《Gecko Active Components Regulates Endoplasmic Reticulum Stress to Induce the Apoptosis of KYSE150 Cells through PERK Pathway》 作者:Yimeng Duan, Lengxin Duan, Zeyue Huang, Bingbing Wang, Jiangang Wang 期刊:Journal of Biosciences and Life Sciences 影響因子:0.552 PMID:
《RNA-binding protein RBM6 as a tumor suppressor gene represses the growth and progression in laryngocarcinoma》 作者:Qiwei Wang,Fang Wang,Waisheng Zhong,Hang Ling,Jixuan Wang,Jie Cui,Tao Xie,Senli Wen,Jie Chen 期刊:Gene 影響因子:2.638 PMID:30772516
《Sphingomyelin synthase 2 promotes H2O2-induced endothelial dysfunction by activating the Wnt/β-catenin signaling pathway》 作者:Panpan Zhang,Lingyue Hua,Huan Hou, Xingyue Du,Zhiqiang He, Menghan Liu, Xiaojuan Hu, Nianlong Yan 期刊:International Journal of Molecular Medicine 影響因子:2.928 PMID:30272329
《Downregulation of transcription factor EB inhibits the growth and metastasis of colorectal carcinomas》 作者:Jin-Zhe Chang,Shu-Dong Chen,Hui Zheng,Hua-Ping Zhang 期刊:European Journal of Inflammation 影響因子:0.733 PMID:
《Circular RNA hsa_circ_0002024 suppresses cell proliferation, migration, and invasion in bladder cancer by sponging miR-197-3p》 作者:Yongjun Jiang, Tingran Wei, Wei Li, Ruihua Zhang, and Maogang Chen 期刊:American journal of Translational Research 影響因子:3.266 PMID:30972190
《Effect of microRNA‐128 on cisplatin resistance of glioma SHG‐44 cells by targeting JAG1》 作者:Dong‐Ye Yi， Qing Su， Fang‐Cheng Zhang， Peng Fu， Qing Zhang， Yong‐Cun Cen， Hong‐Yang Zhao，Wei Xiang 期刊:Journal of Cellular Biochemistry 影響因子:3.448 PMID:29091297
《miR‐377‐5p inhibits lung cancer cell proliferation, invasion, and cell cycle progression by targeting AKT1 signaling》 作者:Han Wu，Haiyan Liu,Wenjie Liu,Yongli Shi,Dawei Bao 期刊:Journal of Cellular Biochemistry 影響因子:3.448 PMID:30485528
《Activity of coumarin against Candida albicans biofilms》 作者:K.Xu  J.L.Wang  M.P.Chu  C.Jia 期刊:Journal de Mycologie Medicale 影響因子:1.479 PMID:30606640
《Gallic acid has anticancer activity and enhances the anticancer effects of cisplatin in non?small cell lung cancer A549 cells via the JAK/STAT3 signaling pathway》 作者:Tingxiu Zhang, Lijie Ma, Pengfei Wu, Wei Li, Ting Li, Rui Gu, Xiaoping Dan, Zhiwei Li, Xianming Fan, Zhenliang Xiao 期刊:Oncology Reports 影響因子:3.041 PMID:30747218
《c-Myc, RMRP, and miR-34a-5p form a positive-feedback loop to regulate cell proliferation and apoptosis in multiple myeloma》 作者:Xichun Xiao,Yueli Gu,Genjie Wang,Shuxia Chen 期刊:International Journal of Biological Macromolecules 影響因子:4.784 PMID:30389523
《Downregulation of lncRNA NEAT1_2 radiosensitizes hepatocellular carcinoma cells through regulation of miR‐101‐3p/WEE1 axis》 作者:Xin Chen, Nuobei Zhang 期刊:Cell Biology International 影響因子:2.127 PMID:30488993
《Knockdown of USP28 enhances the radiosensitivity of esophageal cancer cells via the c‐Myc/hypoxia‐inducible factor‐1 alpha pathway》 作者:Zhang Weili， Liu Zhikun，Wang Jianmin， Tian Qingbao 期刊:Journal of Cellular Biochemistry 影響因子:3.448 PMID:30206969
《Circulating exosomes activate dendritic cells and induce unbalanced CD4+ T cell differentiation in Hashimoto thyroiditis》 作者:Xuejiao Cui, Yongping Liu, Shuo Wang, Na Zhao, Jing Qin, Yushu Li,Chenling Fan, Zhongyan Shan, Weiping Teng 期刊:The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 影響因子:5.605 PMID:31199456
《A Host Factor GPNMB Restricts Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication and Interacts With PCV2 ORF5 Protein》 作者:Kangkang Guo, Lei Xu, Mengmeng Wu, Yufeng Hou, Yanfen Jiang, Jiangman Lv, Panpan Xu, Zhixin Fan, Ruiqi Zhang, Fushan Xing and Yanming Zhang 期刊:Frontiers in Microbiology 影響因子:4.019 PMID:30671053
《Effects of a novel photoactivated photosensitizer on MDR1 over-expressing human breast cancer cells》 作者:Chen Jing-Jing,Liu Shu-Ping,Zhao Jun,Wang Si-Cheng,Liu Tian-Jun,Li Xiang 期刊:Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 影響因子:2.814 PMID:28478351
《Therapeutic effects of Hedyotis diffusa Willd in a COPD mouse model challenged with LPS and smoke》 作者:Renping Liu，Peihong Wang，Caiqing Wu，Juan Chen，Chengxin Li，Yongtao Xie，Qi Wang，Jianming Liu，Huan He，Jing Zhu 期刊:Experimental
   and Therapeutic Medicine 影響因子:1.41 PMID:29545859"
《Trophoblast glycoprotein promotes pancreatic ductal adenocarcinoma cell metastasis through Wnt/planar cell polarity signaling》 作者:Ping He, Shuheng Jiang, Mingze Ma ,Yang Wang, Rongkun Li, Fang Fang, Guangang Tian ,Zhigang Zhang 期刊:Molecular Medicine Reports 影響因子:1.922 PMID:25738465
《LPS?induced proinflammatory cytokine expression in human airway epithelial cells and macrophages via NF?κB, STAT3 or AP?1 activation》 作者:Xuefang Liu, Sugai Yin, Yulong Chen, Yaosong Wu ,Wanchun Zheng, Haoran Dong, Yan Bai, Yanqin Qin, Jiansheng Li, Suxiang Feng, Peng Zhao 期刊:Molecular Medicine Reports 影響因子:1.922 PMID:29393460
《TINAGL1 promotes hepatocellular carcinogenesis through the activation of TGF-β signaling-medicated VEGF expression》 作者:L Sun, Z Dong, H Gu, Z Guo, Z Yu 期刊:Cancer Management and Research 影響因子:3.702 PMID:30697069
《Selective anticancer activity of the novel steroidal dihydropyridine spirooxindoles against human esophageal EC109 cells》 作者:Xiaoli Shi,Tiantian Qin,Weihua Liu,Xueyan Zhang,Leilei Li,Junfeng Huo,Kairui Zhou,Dongxiao Yang,Yanling Zhang,Cong Wang 期刊:Biomedicine & Pharmacotherapy 影響因子:2.068 PMID:
《Evaluation of the cytotoxicity of cigarette smoke total particulate matter using three in vitro assays and two types of cells》 作者:Xiang Li, Bin Peng, Cong Nie, Pingping Shang & Huimin Liu 期刊:Journal Toxicology Mechanisms and Methods 影響因子:1.367 PMID:23193988
《Ethylenecarbodiimide-fixed splenocytes carrying whole islet antigens decrease the incidence of diabetes in NOD mice via down-regulation of effector memory T cells and autoantibodies》 作者:Jiaqi Zou, Xinpu Gao, Tengli Liu, Rui Liang, Yaojuan Liu, Guanqiao Wang, Le Wang, Na Liu, Peng Sun, Zhiping Wang, Shusen Wang, Zhongyang Shen 期刊:Endocrine Journal 影響因子:1.911 PMID:29998909
《SIRT1 expression regulates the transformation of resistant esophageal cancer cells via the epithelial-mesenchymal transition》 作者:Tiantian Qin,Weihua Liu,Junfeng Huo,Leilei Li,Xueyan Zhang,Xiaoli Shi,Jinlei Zhou,Cong Wang 期刊:Biomedicine & Pharmacotherapy 影響因子:2.068 PMID:29656187
《Targeting the Bcl-2 family and P-glycoprotein reverses paclitaxel resistance in human esophageal carcinoma cell line》 作者:Xiaoli Shi,Yinhui Dou,Kairui Zhou,Jinling Huo,Tengjiao Yang,Tiantian Qin,Weihua Liu,Saiqi Wang,Dongxiao Yang,Liming Chang,Cong Wang 期刊:Biomedicine & Pharmacotherapy 影響因子:3.457 PMID:28441715
《High incidence of coding gene mutations in mitochondrial DNA in esophageal cancer》 作者:Zong?Wen Liu, Zhen?Jiang Guo, A?Lan Chu, Yan Zhang, Bing Liang, Xing Guo, Ting Chai, Rui Song, Ge Hou, Jin?Jin Yuan 期刊:Molecular Medicine Reports 影響因子:1.922 PMID:28990096
《在前DC到成熟DC的分化過程中表型和分泌功能的動態(tài)變化》 作者:王晶（汪晶）立博釗（趙利波）升昌（昌盛）Chang-sheng Ming （明長生）楊軍（楊軍） 期刊:華中科技大學學報 影響因子:0.38 PMID:
《Simultaneous determination of saikosaponins in Bupleurum Radix from different locations by high performance liquid chromatography- charged aerosol detection (HPLC-CAD) method and its immunomodulation effects on mouse splenocytes》 作者:Lina Wang, Bin Chen, Wei Wang, Nan Xu and Tianzhu Jia* 期刊:academic Journals 影響因子: PMID:
《Knockdown of hsa_circ_0023028 inhibits cell proliferation, migration, and invasion in laryngeal cancer by sponging miR-194-5p》 作者:Xiaofeng Chen, Xiaoqing Su, Chuansai Zhu, Jing Zhou 期刊:Bioscience Reports 影響因子:2.535 PMID:31123169
《Long Non-Coding RNA NIFK-AS1 Augments the Oncogenicity of Hepatocellular Carcinoma by Regulating miR-497/BIRC5 Axis》 作者:Yajing Feng,Lu Sun,Yajuan Feng,Zhixian Guo 期刊:SSRN 影響因子: PMID:
《Abnormal expression and mutation of the RBPJ gene may be involved in CD59? clonal proliferation in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria》 作者:Liyan Li, Hui Liu, Honglei Wang ,Zhaoyun Liu ,Yingying Chen, Lijuan Li ,Jia Song, Guojin Wang, Rong Fu 期刊:Experimental and Therapeutic Medicine 影響因子:1.448 PMID:31086586
《Prognostic implications and oncogenic roles of MYBL2 protein expression in esophageal squamous-cell carcinoma》 作者:Hui Qin,Yunyun Li, Hongyan Zhang,Feng Wang, Hongliu He, Xue Bai,and Shanshan Li 期刊:OncoTargets and Therapy 影響因子:3.046 PMID:30881043
《Insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 2 promotes aerobic glycolysis and cell proliferation in pancreatic ductal adenocarcinoma via stabilizing GLUT1 mRNA》 作者:Shan Huang , Zheng Wu , Yunyun Cheng , Wenzhen Wei  Linlin Hao 期刊:Acta Biochimica et Biophysica Sinica 影響因子:2.502 PMID:31089713
《In vitro and in vivo studies of antiosteosarcoma activities of formononetin》 作者:Wei Hu , Xianpei Wu,  Jiandong Tang , Niansu Xiao , Guoping Zhao,  Li Zhang , Luanhai Ou 期刊:Journal of Cellular Physiology 影響因子:4.522 PMID:30790283
《Trichomonas vaginalis triggers the release of THP-1 extracellular traps》 作者:Li Fei,Wei Zhengkai,Jiang Weina,Cao Lili,Gao Yuhang,Yang Zhengtao,Li Jianhua,Yu BiaoZhang, Xichen,Gong Pengtao 期刊:Parasitology Research 影響因子:2.067 PMID:30426227