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固相抗原準(zhǔn)備：試劑盒中預(yù)先將經(jīng)過純化處理的支原體特異性抗原，以均一且牢固的方式包被在酶標(biāo)板的微孔內(nèi)壁。這些包被的抗原在微孔表面形成穩(wěn)定的固相抗原層，如同在微孔中布置了 “哨兵"，等待與樣本中的目標(biāo)抗體相遇。
樣本加入與抗體結(jié)合：實驗開始時，將待檢測的血清或血漿樣本按照規(guī)定量加入到包被有固相抗原的微孔中。在適宜的溫度和孵育時間條件下，樣本中的支原體 IgM 抗體憑借其抗原結(jié)合位點，與固相抗原上的相應(yīng)抗原表位發(fā)生特異性結(jié)合。這種結(jié)合具有高度的選擇性，如同鑰匙與鎖的精準(zhǔn)匹配，從而在固相抗原表面形成抗原 - 抗體復(fù)合物。此時，樣本中未與固相抗原結(jié)合的其他物質(zhì)，如其他抗體、蛋白質(zhì)等，暫時留存在反應(yīng)體系中。
酶標(biāo)二抗引入：完成第一步的孵育后，通過多次洗滌操作，利用特定的洗滌緩沖液將未結(jié)合的物質(zhì)從微孔中徹di清除，確保反應(yīng)體系的純凈度。隨后，向微孔中加入酶標(biāo)記的抗人 IgM 抗體（即二抗）。這種酶標(biāo)二抗能夠識別并特異性結(jié)合已結(jié)合在固相抗原上的支原體 IgM 抗體的 Fc 段。由此，在微孔中構(gòu)建起了 “抗原 - 抗體 - 酶標(biāo)二抗" 的夾心結(jié)構(gòu)，其中酶標(biāo)二抗如同攜帶了 “信號發(fā)生器"，為后續(xù)的檢測信號放大奠定基礎(chǔ)。
顯色與結(jié)果判讀：加入酶的特異性底物，該底物在與酶標(biāo)二抗相連的酶的催化作用下，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的顏色變化。在一定范圍內(nèi)，顏色的深淺程度與樣本中支原體 IgM 抗體的含量成正比關(guān)系。通過專業(yè)的酶標(biāo)儀，在特定波長下測定微孔內(nèi)反應(yīng)液的吸光度值。將該吸光度值與試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對分析，即可準(zhǔn)確判斷樣本中是否存在支原體 IgM 抗體，以及其具體含量水平。
抗人 IgM 抗體包被：與間接法不同，捕獲法首先將抗人 IgM 抗體均勻包被在酶標(biāo)板的微孔表面。這層包被的抗人 IgM 抗體猶如一個 “大網(wǎng)"，旨在捕獲樣本中所有類型的 IgM 抗體，無論其是否針對支原體。
樣本加入與 IgM 捕獲：將待測樣本加入到包被有抗人 IgM 抗體的微孔中。在合適的孵育條件下，樣本中的 IgM 抗體（包括支原體 IgM 抗體以及其他非特異性 IgM 抗體）與包被的抗人 IgM 抗體發(fā)生結(jié)合，從而被固定在微孔表面。此時，通過洗滌步驟去除未結(jié)合的其他雜質(zhì)，確保反應(yīng)體系聚焦于已捕獲的 IgM 抗體。
支原體抗原結(jié)合：向微孔中加入支原體特異性抗原，這些抗原會與已被捕獲的支原體 IgM 抗體發(fā)生特異性結(jié)合。由于非特異性 IgM 抗體與支原體抗原無親和力，所以只有支原體 IgM 抗體 - 抗原結(jié)合反應(yīng)能夠發(fā)生。這一步驟如同在已捕獲的 “抗體群" 中，精準(zhǔn)識別出支原體 IgM 抗體，并與之結(jié)合。
酶標(biāo)抗體添加與顯色：接著加入酶標(biāo)記的抗支原體抗原的抗體，該酶標(biāo)抗體與結(jié)合在支原體 IgM 抗體上的抗原特異性結(jié)合，形成 “抗人 IgM 抗體 - IgM - 支原體抗原 - 酶標(biāo)抗體" 的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。最后，加入酶底物，在酶的催化下底物發(fā)生顯色反應(yīng)。同樣，通過酶標(biāo)儀測定吸光度值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，依據(jù)顏色深淺來確定樣本中支原體 IgM 抗體的含量。