上海乾思生物科技有限公司

Western Blotting|實驗技術服務

時間:2015-5-21閱讀:99

關鍵詞:Western Blotting|實驗技術服務
簡介:世界*品牌Western Blotting|實驗技術服務原裝,質量保證,*。
Western Blotting|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
我們具備豐富的蛋白表達設計經驗及實驗操作技巧,承諾客戶不成功不收費。在獲得重組蛋白產品的同時,我們也會提供相應的原始數(shù)據和原始圖片,不需要再額外花費精力重復實驗。另一方面,我們所有的實驗數(shù)據真實可信,我們提供原始的表達菌株和克隆質粒,客戶可以依據我們的實驗報告重復我們的實驗結果。
產品品牌:   http://www.。。com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測序實驗流程:
對于Western Blotting實驗而言,樣品處理是關鍵步驟之一,獲得的蛋白樣品必須均質、可溶,并解離成單個多肽亞基,且盡量減少相互間的聚集,使其zui終僅依賴本身的分子量大小進行分離。當目標蛋白的含量很低時,需要選取目標蛋白含量較高的組織或細胞器(如核抽提物),或者通過免疫沉淀等方式進行富集。通常樣品有重組蛋白、細胞和組織等。
1.樣品收集
1)培養(yǎng)的細胞
貼壁和懸浮細胞收集方式不同,細胞裂解液種類各異,推薦含SDS的凝膠加樣緩沖液裂解,煮沸即可。
2)動物組織
與細胞不同,組織塊由于體積較大,須預先經破碎勻漿處理。
2.樣品定量
樣品電泳前需測定蛋白濃度,以便保證上樣量一致,有利于后續(xù)定量或半定量分析。常用的蛋白質濃度測定方法有好多種,其靈敏度和所需時間不同,且不同的方法會受不同干擾物質的影響,實驗者可根據樣品制備方法(裂解液成分、去垢劑和還原劑種類等)自行選擇。
注意事項:
a. 應盡量避免引入影響后續(xù)定量的雜蛋白(如細胞培養(yǎng)液、蛋白酶抑制劑等)及其他干擾物質;
b. 樣品濃度應適中,1×SDS凝膠加樣緩沖液建議用量:貼壁細胞按10cm2培養(yǎng)皿/0.1ml,懸浮細胞按5×106細胞/0.1ml比例加入;
c. SDS對蛋白質變性和電泳分離至關重要,濃度應控制在2-10%之間,并根據具體需要調整;
d. 制備好的樣品可以在-20℃保存,但時間不宜過長,并避免反復凍融,否則蛋白會發(fā)生降解;
e. 內參對實驗結果至關重要,應選擇合適的內參。
Western印跡含一系列步驟,包括:
?? 用聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白樣品。
?? 將膠上的蛋白轉移到膜上。
?? 鑒定膜上特定蛋白。
下面將從理論和實踐方面討論Western印跡方法。
用1-D或2-D凝膠分離復雜蛋白質混合物
印跡前分離復雜蛋白質混合物的zui常見方法是一維(1-D)SDS-PAGE電泳,它根據蛋白質的分子量進行分離。有時用非變性電泳分離天然蛋白質。盡管這種方法通常缺乏變性電泳的分辨率,但當?shù)鞍醉毐A羯锘钚詴r非常有用。
二維(2-D)凝膠電泳用于分析細胞、組織、和體液蛋白質的組成,是現(xiàn)代蛋白質組學的關鍵技術。2-D免疫印跡可提供分子量和等電點信息,并可用于區(qū)分翻譯后修飾產生的不同蛋白質形式。有些情況下只進行1-D電泳分離也可用免疫印跡對蛋白分型。

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