關(guān)鍵詞:平板細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
簡(jiǎn)介：世界*品牌平板細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)原裝，質(zhì)量保證,*。
平板細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧，承諾客戶不成功不收費(fèi)。我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒，客戶可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
產(chǎn)品品牌：   
測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
概念：
細(xì)胞克隆形成率即細(xì)胞接種存活率，表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞成活并形成克隆的數(shù)量。貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆，而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞?？寺⌒纬陕史从臣?xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。
基本步驟：
1、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，并把細(xì)胞懸浮在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中備用。
2、將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每組細(xì)胞分別以每皿50、100、200個(gè)細(xì)胞的梯度密度分別接種含10mL 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使細(xì)胞分散均勻。置37℃ 5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周。
3、經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細(xì)胞5mL固定15分鐘。然后去固定液，加適量GIMSA應(yīng)用染色液染10～30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。
4、將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。zui后計(jì)算克隆形成率。
克隆形成率 =(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%
平板克隆形成試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗(yàn)成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞一定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不能過大。
PCR反應(yīng)條件：
94℃ 5min（94℃ 30s . 55℃ 30s . 72℃ 45s）x30  72℃ 5min.4℃保溫 
或者
94℃ 5min （94℃ 30s . 64℃ 30s . 72℃ 45s）x10 （94℃ 30s . 66℃ 30s . 72℃ 45s）x10（94℃ 30s . 68℃ 30s . 72℃ 45s）x10  72℃ 5min.4℃保溫
注：
1一般一個(gè)項(xiàng)目要挑選5個(gè)單菌落做菌落PCR
2在以菌落為模板時(shí)要事先準(zhǔn)備相應(yīng)抗性平板，用槍頭挑選菌落時(shí)要先在事先準(zhǔn)備的相應(yīng)平板上劃線標(biāo)記好順序再將槍頭放入上述反應(yīng)體系中攪勻一下。
3該P(yáng)CR 的primer 為通用primer 所以在原來目的片段的大小上加上100-200bp。
瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：取5ul樣品+5ul DNA Loading buffer混勻上樣，150V恒壓電泳20-30min，保存電泳圖片。根據(jù)大小判斷該菌落是否正確。下班前挑?。ㄔ趧澗€的板子上）篩選正確的菌體接種到5ml 含相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基37℃ 200rmp培養(yǎng)。
常用以下方法獲得DNA片段：
①用限制性核酸內(nèi)切酶將高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；
②用物理方法(如超聲波)取得DNA隨機(jī)片段；
③在已知蛋白質(zhì)的氨基酸順序情況下，用人工方法合成對(duì)應(yīng)的基因片段；
④從mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA。