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HPLC故障排除3 - 鬼峰的出現(xiàn)及解決

2019-6-4  閱讀(1354)

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3.鬼峰問(wèn)題

 鬼峰問(wèn)題

 預(yù)防措施和解決方案

 鬼峰

柱或注射器被污染 (色譜柱或進(jìn)樣器污染)

僅使用HPLC級(jí)溶劑 

沖洗柱,以去除雜質(zhì) 

在注射器用于下一個(gè)分析物時(shí),應(yīng)先進(jìn)行沖洗

前一個(gè)注射導(dǎo)致的遲洗脫峰(前一次進(jìn)樣的后洗脫峰)  

延長(zhǎng)運(yùn)行時(shí)間

每次運(yùn)行結(jié)束時(shí)用強(qiáng)流動(dòng)相沖洗色譜柱

對(duì)于梯度運(yùn)行,應(yīng)以較高濃度結(jié)束(有機(jī)相比例結(jié)束梯度)  

RP HPLC中,水被污染1. 使用HPLC級(jí)水
樣本中的未知(未知雜質(zhì))干擾1. 使用樣品清理(凈化措施)(例如SPE 

 負(fù)峰

溶質(zhì)折射率低于流動(dòng)相(RI檢測(cè)器)  

使用折射率較低的流動(dòng)相 

調(diào)換檢測(cè)器極性以獲得正峰值 

溶質(zhì)的吸收低于流動(dòng)相的吸收(溶質(zhì)的紫外吸收低于流動(dòng)相的紫外吸收)(UV檢測(cè)器)

更改UV波長(zhǎng) 

使用UV吸收較低的流動(dòng)相

樣品溶劑和流動(dòng)相的成分不同

1. 如可能,更換樣品溶劑并將樣品溶解在流動(dòng)相(更換樣品溶劑,如有可能,使用流動(dòng)相溶解樣品) 

 峰值(毛刺)

流動(dòng)相中存在氣泡

對(duì)流動(dòng)相脫氣 

在檢測(cè)器出口端,安裝背壓限制器。 

確保所有配件安裝緊固

柱儲(chǔ)存時(shí)未使用端帽 (堵頭)

柱儲(chǔ)存時(shí)應(yīng)使用端帽 

用脫氣的甲醇沖洗RP 

 
 

3.1.等度分離中出現(xiàn)的意外寬峰是因前次運(yùn)行產(chǎn)生的峰洗脫延遲(在等度分離中,前次運(yùn)行中的遲洗脫組分以寬峰的形式意外出現(xiàn))。

對(duì)于等度分離,保留時(shí)間越長(zhǎng),峰應(yīng)(色譜峰)越寬;但色譜圖狹窄區(qū)域內(nèi)的所有峰應(yīng)具有大致相同的峰寬。如圖11(箭頭)所示,當(dāng)窄峰中出現(xiàn)寬峰時(shí),可能是因?yàn)橹白⑸洌ㄇ按芜M(jìn)樣)的化合物發(fā)生了洗脫延遲。這很容易檢查。

只需進(jìn)行正常注射(進(jìn)樣),但將運(yùn)行時(shí)間延長(zhǎng)兩到三倍。如果在正常運(yùn)行時(shí)間結(jié)束后出現(xiàn)峰值(出峰),那就是因洗脫延遲導(dǎo)致的。

可以通過(guò)延長(zhǎng)正常運(yùn)行時(shí)間,以涵蓋此峰的洗脫(洗脫時(shí)間將峰洗脫出來(lái));也可以在每次運(yùn)行結(jié)束時(shí)加入強(qiáng)溶劑沖洗液,以(來(lái))清洗柱中的頑固物質(zhì)。

圖11.峰延遲洗脫通常在38.5分鐘時(shí)出現(xiàn)(遲洗脫峰(正常情況下在第38.5分鐘出現(xiàn)的洗脫峰)),位于(出現(xiàn)在了)下一個(gè)縮短的等度運(yùn)行的色譜圖的12.0分鐘(箭頭)處。來(lái)源[6]。

 

3.2.通過(guò)運(yùn)行非注射(無(wú)進(jìn)樣)空白梯度并觀察基線,可以分離梯度運(yùn)行中的鬼峰。

如圖12a所示,當(dāng)空白梯度出現(xiàn)過(guò)多的峰時(shí),試劑污染可能是導(dǎo)致此問(wèn)題的原因之一(可能是溶劑污染所致)。

在這種情況下,圖12a顯示運(yùn)行過(guò)程中的峰值(峰)非常?。?-3 mAU),并且在0.8-1.0 AU范圍內(nèi)的主要成分分析中幾乎沒(méi)有峰值(對(duì)0.8-1.0 AU大小的主要成分檢測(cè)峰沒(méi)有影響);但是對(duì)于穩(wěn)定性(性指標(biāo)檢測(cè))或雜質(zhì)的測(cè)定,1-2 mAU范圍內(nèi)的峰值應(yīng)需要量化(也需要定量)。

在這種情況下,則需要進(jìn)一步的研究。

在梯度運(yùn)行之間的平衡期間,流動(dòng)相中的非極性雜質(zhì)一般沉積(聚集)在柱的頂部位置。然后,在梯度過(guò)程中,像其它峰一樣,這些雜質(zhì)被洗脫出來(lái)。

通過(guò)將平衡時(shí)間延長(zhǎng)至三倍,檢查問(wèn)題的根源。如果空白梯度中的峰值(峰)增加約三倍,則水狀溶劑有可能是問(wèn)題的致因(則極可能是水溶液中的雜質(zhì)所致)。

如圖12b所示,可將水和/或添加劑換成純度較高的成分,以解決這一問(wèn)題。

圖12. 運(yùn)行空白梯度:(a)A容器受到污染的水(A容器中溶劑有雜質(zhì))和(b)A容器中純度較高的水。色譜柱:150x4.6mm C18;1.5mL/min;35℃;在255 nm處進(jìn)行UV檢測(cè)。梯度:0-83%ACN /水運(yùn)行13分鐘,并保持5分鐘。來(lái)源[7]。

 

3.3.等度或梯度運(yùn)行的負(fù)峰不如正峰常見(jiàn)(相對(duì)于正峰較為少見(jiàn)),但也會(huì)發(fā)生。

負(fù)峰在離子對(duì)或其它方法中更為常見(jiàn),其中流動(dòng)相試劑在選定的檢測(cè)波長(zhǎng)下具有顯著的紫外線吸光度(倒峰在有離子對(duì)或流動(dòng)相在檢測(cè)波段下有明顯紫外吸收的情況下更為常見(jiàn))。

在這種情況下,背景吸光度將極為重要(背景吸收可能較顯著)(可能為0.5 AU或更多),但不會(huì)被注意到(較難覺(jué)察),因?yàn)橄到y(tǒng)在每次運(yùn)行開(kāi)始時(shí)會(huì)自動(dòng)調(diào)節(jié)至零點(diǎn),并檢測(cè)信號(hào)。

如果化合物的吸光度低于流動(dòng)相背景(背景吸光度),其會(huì)顯示為負(fù)峰。

致因的確認(rèn)和峰的消除方式與正峰相同(確認(rèn)問(wèn)題來(lái)源并消除倒峰的方法與正峰相同):檢查水、試劑或樣品的制備過(guò)程。

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