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中級(jí)會(huì)員 | 第12年

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α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase, α-GC)試劑盒說(shuō)明書(shū)

時(shí)間:2022/5/30閱讀:716
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微量法 100 /48

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義:

α-GC(EC 3.2.1.20)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,催化水解芳基或烴基與糖基之間的α-糖苷鍵生成葡萄糖,不僅與細(xì)胞壁的松弛或加固有關(guān),而且與細(xì)胞識(shí)別和一些信號(hào)分子產(chǎn)生密切相關(guān)。

測(cè)定原理:

α-GC 分解對(duì)-硝基苯-α-D 吡喃葡萄糖苷生成對(duì)-硝基苯酚,后者在 400nm 有最大吸收峰, 通過(guò)測(cè)定吸光值升高速率來(lái)計(jì)算α-GC 活性。

自備用品:

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制:

提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存。

試劑一:粉劑×1 瓶,-20℃保存;臨用前加入 12mL 蒸餾水,充分溶解備用;用不完的試劑仍-20℃保存。

試劑二:液體 15mL×1 瓶,4℃保存。試劑三:液體 15mL×1 瓶,4℃保存。粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量

104 個(gè):提取液體積mL 500~10001 的比例(建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液,超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30  15000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

2、組織:按照組織質(zhì)量g:提取液體積(mL) 15~10 的比例建議稱(chēng)取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液,進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 400nm,蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表

試劑名稱(chēng)(μL

測(cè)定管

對(duì)照管

試劑一

120


蒸餾水


120

試劑二

150

150

樣本

30

30

充分混勻,放入 37℃準(zhǔn)確水浴 30min 后,立即放入 95℃水浴 5min蓋緊,以防止水分散失流水冷卻后充分混勻以保證濃度不變,8000g,4℃,離心 5min,取上清液(在 EP 管或 96 孔板中加入下列試劑


上清液

70

70

試劑三

130

130

充分混勻,室溫靜置 2min 后, 400nm 處測(cè)定吸光值 A,計(jì)算 ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。


α-GC 活力計(jì)算:

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為 y = 0.00585x -0.0027;x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度nmol/mLy 為吸光

值。

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

α-GC 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反總]÷(V ×Cpr)÷T

=56.98×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計(jì)算:

單位的定義:每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

α-GC 活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V 反總]÷(W×V ÷V 樣總)÷T

=56.98×(ΔA+0.0027) ÷W

(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

單位的定義:每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

α-GC 活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反總]÷(500×V ÷V 樣總)÷T

=0.114×(ΔA +0.0027)

V 反總:反應(yīng)體系總體積,0.3mL;V 樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.03mL;V 樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g 500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬(wàn);T:反應(yīng)時(shí)間,30min。

 

b.  96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為 y =  0.0039x  -0.0027;x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度nmol/mL,y 為吸光

值。

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

α-GC 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反總]÷(V ×Cpr)÷T

=85.47×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計(jì)算:

單位的定義:每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

α-GC 活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V 反總]÷(W×V ÷V 樣總)÷T

=85.47×(ΔA+0.0027) ÷W

(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

單位的定義:每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活性單位。

α-GC 活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反總]÷(500×V ÷V 樣總)÷T

=0.171×(ΔA +0.0027)

V 反總:反應(yīng)體系總體積,0.3mL;V 樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.03mL;V 樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g; 500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬(wàn);T:反應(yīng)時(shí)間,30min。


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