細(xì)胞胱硫醚-β-合成酶CBS活性酶連續(xù)循環(huán)光度法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

細(xì)胞胱硫醚-β-合成酶（Cystathionine-β-synthase；CBS）活性酶連續(xù)循環(huán)光度法定量檢測試劑是一種旨在使用胱硫醚-β-合成酶、賴氨酸脫羧酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和蘋果酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光度法測定其氧化后峰值（NADH濃度）的變化，以此進(jìn)行測算單位酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種動物和人體細(xì)胞裂解懸液等胱硫醚-β-合成酶的活性檢測。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測敏感。

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；底物液（Reagent F），避免光照，有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于細(xì)胞脫離

（微型）臺式離心機(jī)：用于樣品制備

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度分析的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于光度分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；底物液（Reagent F）注意避光；緩沖液（Reagent C）室溫下預(yù)熱。然后進(jìn)行下列操作。

一、 樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁷細(xì)胞）

2． 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）

7． 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入100至500微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

11． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、測定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好上述待測樣品，置于冰槽里 

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長為340nm，間隔2分鐘，讀數(shù)6次（共10分鐘），并置零

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、 背景對照測定

1． 移取140微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入10微升酶促液（Reagent D）

3． 加入20微升反應(yīng)液（Reagent E）

4． 加入20微升底物液（Reagent F）

5． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入10微升陰性液（Reagent G）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)10分鐘

四、 樣品活性測定

1． 移取150微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入10微升酶促液（Reagent D）

3． 加入20微升反應(yīng)液（Reagent E）

4． 加入20微升底物液（Reagent F）

5． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入10微升待測樣品（注意：100微克總蛋白；樣品須溶解）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)10分鐘

五、 計(jì)算樣品活性

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X  0.2 （體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 10（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升