大鼠腺垂體細胞原代培養(yǎng)

大鼠腺垂體細胞原代培養(yǎng)

原理：

采用酶消化法分次消化腺垂體，進行原代培養(yǎng)。

材料：SD大鼠、胰蛋白酶、膠原酶、DNA酶I、DMEM等。

方法：

1SD大鼠經(jīng)過1%戊芭比妥鈉腹腔麻醉，打開胸腔，剪破心臟放血，用75%究竟浸泡后移入細胞培養(yǎng)室，開顱取腺垂體。

2、將腺垂體用D-Hank`s液一次沖洗三次，移入青霉素瓶內(nèi)剪破至糊狀，分別加入0.375%胰蛋白酶、600u/ml膠原酶和200u/mlDNA酶I（1:1:1），37℃振蕩消化30分鐘，吸管吹打，吸出細胞懸液移入含有新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)液內(nèi)中止消化，4℃保存。余下的為消化的組織塊補加消化酶，37℃二次消化20分鐘。

3、終止消化后，1000rpm離心5分鐘，棄上清液，加DMEM培養(yǎng)液5ml，輕吹起細胞，1000rpm離心5分鐘，棄上清液，加入含100ml/L小牛血清的DMEM液，吹打均勻。

4、用血細胞計數(shù)板鏡檢細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度，以5x10/L的密度接種于直徑6cm的培養(yǎng)基和96孔板內(nèi)，移入CO孵箱中，在37℃，在37℃，50ml/L CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，24小時后換液，之后每隔48小時換液一次。

注意事項：

1、為避免殘留的血液影響消化效果，要充分放血。

2、取腺垂體時要小心，力度適中，避免把垂體夾碎。