PCR-ELISA原理及操作

PCR-ELISA原理及操作

PCR-ELISA是一種將PCR性與ELISA高特異性結(jié)合在一起的轉(zhuǎn)基因檢測方法。利用共價交聯(lián)在PCR管壁上的寡核苷酸作為固相引物，在Taq酶作用下，以目標(biāo)核酸為模板進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物一部分交聯(lián)在管壁上成為固相產(chǎn)物，一部分游離于液體中成為也想產(chǎn)物。對于固相產(chǎn)物，可用標(biāo)記探針與之雜交，再用堿性磷酸酯酶標(biāo)記的鏈親合素進(jìn)行ELISA檢測，同時可通過凝膠電泳對液相產(chǎn)物進(jìn)行分析。

1. 固相引物的包被 固相引物的包被時指利用特殊試劑將5`磷酸化或氨基化的引物特異性地固定在附著物上，它是故鄉(xiāng)擴(kuò)增的前提，也是雜交檢測的基礎(chǔ)。附著物的種類很多，如消化纖維、尼龍膜、聚苯乙烯等。我們用處理過的PCR管壁充當(dāng)附著物，目的是方便隨后的PCR擴(kuò)增。Gilham認(rèn)為，理想的固定是DNA分子的單一位點(diǎn)共價固定在附著物上，他利用碳二亞胺將5`端磷酸化的DNA分子固定在紙上，寶貝上的DNA分子可以通過同位素標(biāo)記探針進(jìn)行定量，通常有20-50ng的核酸分子可以吸附到管壁上，這樣1-2nm長的引物就排列在管壁上。一般來說，吸附在管壁上的寡核苷酸大約有35-50ng，高濃度的寡核苷酸并不能提高吸附量。包被的效果與溫度、時間、核酸分子的濃度以及緩沖液的種類和PH值等有關(guān)。

EDC在包被過程中起到橋梁作用，它以共價鍵的形成與固相引物的磷酸基團(tuán)結(jié)和，激活寡核苷酸。EDC溶于水后極不穩(wěn)定，活化后的寡核苷酸半衰期很短，這個操作帶來不便。如果先加寡核苷酸混合物中加入甲基咪唑會解決不穩(wěn)定的現(xiàn)象，火花的寡核苷酸即使過ye也不會影響結(jié)果。EDC極易吸潮，必須干燥貯存于-20℃，分成等份，沒分用于一次包被

EDC的濃度對包被效果有較大影響，zui適濃度為10mmol/L.5-12.5mml/L之間沒有太大的差異。EDC的濃度增加到16mmol/L時，包被上的寡核苷酸的量急劇下降，增加到100mmol/L后，幾乎檢測不到引物。

大量實(shí)驗(yàn)證明，*包被條件為10mmol/L的甲基咪唑，10mmol/LEDC，ph7.0，50℃反應(yīng)5h，核酸的濃度一般為100mmol/L，高濃度的核酸只能稍微縮短反應(yīng)時間而不能提高結(jié)合上的分子的量。包被好的PCR管可在4℃或更低溫度下存放半年以上。

PCR擴(kuò)增  在包被寡核苷酸的管內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增和條件因目的片段而異，對35S啟動子和NOS終止子，PCR反應(yīng)體系為：10倍緩沖液5ul，25mmol/L Mg2 4ul，10mmol/LdNTPs 1ul，25umol/L引物11ul，8umol/L引物2（固相引物）1ul,Taq酶2u，加水至50ul。固相引物與液相引物的濃度比值決定了兩種產(chǎn)物的量，1:1利于瓊脂糖凝膠電泳檢測，8:1利于雜交檢測，同時也適合凝膠電泳分析。35S啟動子和NoS終止子的擴(kuò)增條件如下：94℃5min，54℃55s,72℃1min，1個循環(huán)：94℃30s，72℃30s，35個循環(huán)：72℃延伸8min。NPTII的退火溫度為50℃，其他條件同上。

ELISA檢測  變形后的固相產(chǎn)物在5倍SSC（含0.5%BR）中雜交1h，雜交溫度因探針而異，一般在45-50℃都能得到較好的效果，雜交后用0.5倍SSC，0.1%吐溫-20洗掉非特異性結(jié)合的探針，加入100ulLAP（1:2500）使之與探針上的地gao辛結(jié)合，10mg/mL的PNPP顯色30min后，通過酶標(biāo)儀讀數(shù)。去掉空白對照，高于10為陽性，低于0.1為陰性。

PCR-ELISA的又定

1 高靈敏度 2 可靠性  3半定量檢測