PI3KCIIα-Dependent Autophagy Program Protect From Endothelial Dysfunction and Atherosclerosis in Response to Low Shear Stress in Mice
Keywords: atherosclerosis; autophagy; endothelial cell; phosphoinositide 3-kinase; primary cilium; shear stress.

動(dòng)脈粥樣硬化是一種累及大動(dòng)脈和中動(dòng)脈的復(fù)雜、多因素性病變，在心血管疾病中占有很大比例。衰老或代謝紊亂在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊沉積的diyi步中損害內(nèi)皮屏障完整性的主要誘發(fā)因素。除了全身因素外，內(nèi)皮細(xì)胞（EC）單層還不斷暴露于血流和相關(guān)的流體剪切應(yīng)力中。剪切應(yīng)力強(qiáng)烈影響EC穩(wěn)態(tài)，不同的剪切應(yīng)力模式?jīng)Q定了動(dòng)脈粥樣硬化病變沿血管樹(shù)的不均勻分布。

自噬是一種由各種細(xì)胞應(yīng)激誘導(dǎo)的分解代謝過(guò)程，它被激活以確保細(xì)胞質(zhì)成分被自噬體隔離并輸送到溶酶體進(jìn)行降解和回收。自噬體的生物發(fā)生由 ULK1/PIK3C3 復(fù)合物I（VPS34-VPS15-Beclin1-ATG14L）啟動(dòng)，其中VPS34是 Ⅲ型磷脂酰肌醇激酶（PI3K-Ⅲ），其催化底物磷脂酰肌醇（PI）磷酸化生成的3-磷酸磷脂酰肌醇（PI3P）為自噬小體形成所必需的。研究表明，自噬程序被激活以響應(yīng)高流體剪切應(yīng)力（HSS），誘導(dǎo)內(nèi)皮保護(hù)并預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。相比之下，低流體剪切應(yīng)力（LSS）在內(nèi)皮細(xì)胞中觸發(fā)的自噬反應(yīng)不太明顯。然而，尚不清楚LSS和HSS是否在不同的激活水平上驅(qū)動(dòng)相同的信號(hào)通路，或者使用不同的信號(hào)模塊來(lái)控制EC功能。

鑒于此，法國(guó)INSERM-圖盧茲大學(xué)代謝與心血管疾病研究所及意大利都靈分子生物技術(shù)中心等的研究團(tuán)隊(duì)曾探討了小鼠體內(nèi)不同動(dòng)脈剪切應(yīng)力區(qū)域以及體外流動(dòng)室中EC的自噬過(guò)程，發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈內(nèi)皮LSS和HSS涉及不同的自噬信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊，需要不同類(lèi)別的PI3K。研究工作揭示了 II 類(lèi) PI3Kα 在控制自噬中的重要作用，并證明這種機(jī)制是由PI3KCIIα-（磷酸肌醇 3-激酶II 類(lèi)α）依賴性初級(jí)纖毛組裝調(diào)控驅(qū)動(dòng)的。具體研究成果發(fā)表在 Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 期刊題為“PI3KCIIα-Dependent Autophagy Program Protect From Endothelial Dysfunction and Atherosclerosis in Response to Low Shear Stress in Mice"。

首先，為了探索LSS驅(qū)動(dòng)內(nèi)皮自噬過(guò)程的潛在機(jī)制，研究了VPS34和PI3KCIIα表達(dá)水平在ECs對(duì)LSS的響應(yīng)。與靜態(tài)培養(yǎng)的ECs相比，LSS（1 dyne/cm2）持續(xù)24 h的ECs中PI3KCIIα蛋白水平顯著升高（圖1 A），VPS34表達(dá)水平保持不變（圖1 B），表明PI3KCIIα優(yōu)先參與ECs對(duì)LSS的響應(yīng)。

為了研究這些PI3Ks在LSS和HSS誘導(dǎo)的自噬中的潛在作用，使用小干擾RNA敲低PI3KCIIα和VPS34（圖1 C、J），與陰性對(duì)照細(xì)胞相比，PI3KCIIα敲低后，LSS誘導(dǎo)的LC3B陽(yáng)性結(jié)構(gòu)急劇降低，而VPS34敲低則沒(méi)有影響（圖1 C）。這些結(jié)果在毛細(xì)管和蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)（圖1 D）。相比之下，HSS（18 dynes/cm2）對(duì)ECs中LC3-B表達(dá)的分析表明，敲低VPS34導(dǎo)致自噬減少，而敲低PI3KCIIα則沒(méi)有影響（圖1 G、H）。

這些結(jié)果證明了PI3KCIIα而非VPS34在內(nèi)皮LSS-相關(guān)自噬機(jī)制動(dòng)員中的重要性，并強(qiáng)調(diào)了內(nèi)皮中不同機(jī)械力誘導(dǎo)的分子機(jī)制的特異性。

圖1     不同的PI3K（磷酸肌苷3-激酶）信號(hào)模塊控制自噬響應(yīng)剪切應(yīng)力。

為了進(jìn)一步研究PI3KCIIα在體內(nèi)動(dòng)脈疾病背景下EC生物學(xué)中的自噬功能，建立了載脂蛋白E基因缺失（ApoE?/?）小鼠和PI3KCIIα雜合缺失（PI3KCIIα+/?）小鼠，發(fā)現(xiàn)與 ApoE?/? 小鼠動(dòng)脈的 LSS 區(qū)域相比，ApoE?/?PI3KCIIα+/? 小鼠內(nèi)皮LC3B標(biāo)志物強(qiáng)度顯著降低，而HSS區(qū)內(nèi)皮中LC3B表達(dá)無(wú)變化，表明PI3KCIIα表達(dá)降低會(huì)損害體內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)皮LSS區(qū)域的自噬。

接下來(lái)，研究了PI3KCIIα依賴性自噬去除對(duì)EC功能的影響。通過(guò)分析PI3KCIIα雜合缺失對(duì)主動(dòng)脈LSS和HSS區(qū)域EC形態(tài)的影響（圖2 A），發(fā)現(xiàn)ApoE?/?PI3KCIIα+/? 小鼠主動(dòng)脈弓EC的大小明顯增加（圖2 B、C）。PI3KCIIα表達(dá)降低的小鼠中EC面積的增加與兩種基因型中相同內(nèi)皮區(qū)域主動(dòng)脈弓細(xì)胞數(shù)量的減少相關(guān)（圖2 D）。相比之下，在兩種基因型的小鼠的降主動(dòng)脈中均未發(fā)現(xiàn)EC大小或EC數(shù)的變化（圖2 E-G），表明PI3KCIIα表達(dá)降低特異性影響了動(dòng)脈LSS區(qū)域的EC形態(tài)。

由于 EC 的主要功能是維持屏障完整性，因此研究了這種形態(tài)變化是否伴隨著 LDL（低密度脂蛋白）跨內(nèi)皮通量的變化。結(jié)果表明，PI3KCIIα的缺失導(dǎo)致體外ECs中穿胞作用顯著增加（圖2 H），表明PI3KCIIα是防止膽固醇在內(nèi)皮下空間沉積所必需的。此外，還觀察到PI3KCIIα敲低HUAEC 中DNA 損傷標(biāo)記物磷酸化-H2AX 和衰老標(biāo)志物p16 表達(dá)顯著增加（圖2 I、J），而ApoE?/? 與ApoE?/?PI3KCIIα+/? 小鼠EC中促炎細(xì)胞因子和炎性粘附分子的表達(dá)水平?jīng)]有改變。這些數(shù)據(jù)表明，PI3KCIIα 是內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子，特別是通過(guò)自噬在LSS區(qū)域。

此外，還評(píng)估了自噬存在內(nèi)在缺陷的 ApoE?/?PI3KCIIα+/? 小鼠中的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊負(fù)荷（圖2 K），觀察到小鼠LSS 區(qū)域的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊沉積顯著增加，但在 HSS 區(qū)域則沒(méi)有（圖2 L-N），血漿膽固醇水平也沒(méi)有變化（圖2 O）。這些數(shù)據(jù)表明，LSS特異性區(qū)域自噬的喪失導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化增加。

圖2    PI3KCIIα的雜合缺失會(huì)損害內(nèi)皮細(xì)胞低剪切應(yīng)力（LSS）區(qū)域的穩(wěn)態(tài)，增加動(dòng)脈粥樣硬化。

雷帕霉素復(fù)合物1（mTORC1）通路是多種細(xì)胞類(lèi)型中細(xì)胞大小和自噬的中心調(diào)節(jié)因子，并且是不同病理學(xué)中zhongsuozhouzhi的藥物靶點(diǎn)。為了進(jìn)一步研究上述發(fā)現(xiàn)的分子和藥理學(xué)意義，假設(shè) mTORC1 通路可以將 PI3KCIIα 與內(nèi)皮細(xì)胞的自噬聯(lián)系起來(lái)。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，在體外 LSS 下評(píng)估其效應(yīng)子p70-S6 激酶在存在或不存在 PI3KCIIα 下的磷酸化水平來(lái)測(cè)量 mTORC1 激活水平，觀察到PI3KCIIα的缺失導(dǎo)致磷酸化-p70-S6激酶水平顯著升高，表明mTOR受PI3KCIIα負(fù)調(diào)控（圖3 A）。

為了證實(shí)這種機(jī)制在體內(nèi)的重要性，評(píng)估了 mTOR 的藥理學(xué)抑制是否可以恢復(fù)因 PI3KCIIα 表達(dá)降低而改變的內(nèi)皮功能。將ApoE?/?PI3KCIIα+/? 小鼠給予依維莫司（mTOR抑制劑）處理（圖3 B），發(fā)現(xiàn)依維莫司導(dǎo)致在 LSS 區(qū)域自噬顯著增加（圖3 C、D），并恢復(fù)EC大?。▓D3 G、H），而對(duì)HSS區(qū)域這兩個(gè)參數(shù)沒(méi)有任何影響（圖3 E、F、I、J），這表明 PI3KCIIα 在控制動(dòng)脈 LSS 區(qū)域的 mTOR 信號(hào)傳導(dǎo)中的重要性。此外，實(shí)驗(yàn)證明了依維莫司處理在ApoE?/?PI3KCIIα+/? 小鼠中顯著減少動(dòng)脈粥樣硬化沉積，表明mTORC1 調(diào)控將 PI3KCIIα 與自噬聯(lián)系起來(lái)以響應(yīng) LSS，抑制mTORC1可以抵消這種病理背景下PI3KCIIα的缺失。

圖3    依維莫司治療可恢復(fù)小鼠內(nèi)皮細(xì)胞自噬，降低PI3KCIIα表達(dá)。

最后，為了進(jìn)一步研究 PI3KCIIα 和 mTOR 調(diào)控之間的聯(lián)系，研究人員探討了初級(jí)纖毛的影響。初級(jí)纖毛是一種重要的機(jī)械傳感器，一些研究描述了PI3KCIIα是調(diào)控初級(jí)纖毛生物合成的關(guān)鍵酶，并證明 mTOR 信號(hào)可由初級(jí)纖毛激活。實(shí)驗(yàn)觀察到動(dòng)脈LSS區(qū)域的ECs上初級(jí)纖毛的富集。與ApoE?/? 小鼠動(dòng)脈的LSS區(qū)域相比，ApoE?/?PI3KCIIα+/? 小鼠中的初級(jí)纖毛數(shù)量總體減少，纖毛縮短。這些結(jié)果表明，PI3CIIα控制內(nèi)皮初級(jí)纖毛的生物發(fā)生以響應(yīng)LSS。

然后敲低纖毛發(fā)生關(guān)鍵基因IFT88以研究在PI3KCIIα缺失的情況下是否會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)穩(wěn)態(tài)缺陷（圖4 A、B）。在IFT88缺失的EC中，初級(jí)纖毛減少（圖4 C），缺乏LC3B陽(yáng)性結(jié)構(gòu)（圖4 D），LC3-B表達(dá)降低（圖4 E），EC增大（圖4 F、G）。這些結(jié)果與在沒(méi)有PI3KCIIα的情況下觀察到的結(jié)果相似，表明PI3KCIIα的缺失模擬了原發(fā)性纖毛缺陷表型，表明該激酶可能通過(guò)初級(jí)纖毛調(diào)控LSS誘導(dǎo)的自噬和EC穩(wěn)態(tài)。

圖4    PI3KCIIα 缺乏模擬內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的原發(fā)性纖毛缺失。

圖5    圖形概要

總的來(lái)說(shuō)，該研究結(jié)果表明，動(dòng)脈系統(tǒng)內(nèi)的機(jī)械應(yīng)力變異性決定了EC的自噬反應(yīng)，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化有直接影響。這項(xiàng)工作揭示了PI3KCIIα/mTOR是LSS區(qū)域內(nèi)皮機(jī)械傳感的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并闡明了內(nèi)皮初級(jí)纖毛在動(dòng)脈粥樣硬化病因中的重要作用。

參考文獻(xiàn)：Nasr M, Fay A, Lupieri A, Malet N, Darmon A, Zahreddine R, Swiader A, Wahart A, Viaud J, Nègre-Salvayre A, Hirsch E, Monteyne D, Perez-Morgà D, Dupont N, Codogno P, Ramel D, Morel E, Laffargue M, Gayral S. PI3KCIIα-Dependent Autophagy Program Protects From Endothelial Dysfunction and Atherosclerosis in Response to Low Shear Stress in Mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2024 Mar;44(3):620-634. doi: 10.1161/ATVBAHA.123.319978. Epub 2023 Dec 28. PMID: 38152888.

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