3型固有淋巴細(xì)胞（ILC3）是腸道免疫領(lǐng)域的關(guān)鍵參與者，在腸道淋巴組織發(fā)育、屏障完整性、耐受菌群和飲食抗原等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。ILC3 對(duì)周圍的微環(huán)境高度敏感。越來(lái)越多的研究已經(jīng)確定了ILC3和腸道上皮之間的許多信號(hào)模塊，這些模塊在各種穩(wěn)態(tài)和炎癥過(guò)程中都很重要。這些研究都集中在ILC3信號(hào)對(duì)上皮細(xì)胞的影響上，其中白細(xì)胞介素-22（IL-22）在上皮細(xì)胞的多效性、環(huán)境依賴性和亞群特異性調(diào)控中處于中心位置。然而，ILC3 可以產(chǎn)生其他細(xì)胞因子和信號(hào)因子，可能與 IL-22 協(xié)同調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞。此外，上皮-ILC3信號(hào)模塊也可能是雙向的，如上皮-ILC3相互作用在炎癥性疾?。ㄈ缪装Y性腸病IBD）中的變化。

為了探索 ILC3-上皮腸道的相互作用，倫敦國(guó)王學(xué)院宿主-微生物相互作用中心、曼徹斯特大學(xué)生物醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院及瑞典哥德堡大學(xué)醫(yī)學(xué)生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)系的研究團(tuán)隊(duì)在小鼠上皮小腸類器官（SIO）和小腸固有層（SILP）衍生的 ILC3 之間采用了體外共培養(yǎng)系統(tǒng)，用于描述 ILC3 衍生的 IL-22 對(duì)腸上皮細(xì)胞再生的影響并驗(yàn)證與神經(jīng)肽激活的 ILC3 共培養(yǎng)后腸上皮細(xì)胞中 IL-22 靶基因的上調(diào)。該研究旨在確定 ILC3 和腸道上皮之間的新信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊，并表征這些通路對(duì)上皮和 ILC 區(qū)室的影響。研究成果發(fā)表在 Mucosal Immunology 期刊題為“Bi-directional signaling between the intestinal epithelium and type-3 innate lymphoid cells regulates secretory dynamics and interleukin-22"。

首先，為了辨別 ILC3 對(duì)上皮表型的影響，使用 ILC3 的異質(zhì)亞群（包括 CCR6- NKp46+/- 亞群和 CCR6+ LTi 樣細(xì)胞）建立 SIO 共培養(yǎng)，以創(chuàng)建 ILC3 區(qū)室的代表性模型，比較了從SIO中分離出的腸上皮細(xì)胞（IEC）與ILC3共培養(yǎng)（IEC + ILC3）與在相同培養(yǎng)條件下不添加ILC3（IEC ONLY）的IEC的轉(zhuǎn)錄組。GSEA分析顯示 IEC + ILC3 中分泌型杯狀細(xì)胞和潘氏細(xì)胞特征顯著富集，幾種典型杯狀細(xì)胞（例如 Spedf、Muc3、Muc2）和潘氏細(xì)胞（Defa23、Mmp7、Lyz）標(biāo)志物的表達(dá)增加。這些數(shù)據(jù)表明，ILC3 促進(jìn)了 SIO 模型系統(tǒng)中某些分泌型腸上皮特征的富集。

然后，實(shí)驗(yàn)試圖表征這些分泌細(xì)胞如何影響共培養(yǎng)中的 ILC3 （圖1 A），生成了富含潘氏細(xì)胞（PAN）和杯狀細(xì)胞（GOB）的SIO方案。NCR+ ILC3 亞群是 IL-22 的重要生產(chǎn)者，且腸黏膜中IL-22 + ILC3減少與IBD的發(fā)生相關(guān)。與GOB共培養(yǎng)后，觀察到與SIO或PAN共培養(yǎng)相比，NKp46+ ILC3的比例顯著增加（圖1 B、C）。與 SIO 相比，GOB 共培養(yǎng)后 ILC3 中 NKp46 的表達(dá)更高（圖1 D）。然后將 NKp46- 和 NKP46+ ILC3 分別接種到 SIO 或 GOB 共培養(yǎng)物中，發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)的SIO共培養(yǎng)相比，GOB僅增加了NKp46- ILC3共培養(yǎng)物中NKp46+ ILC3的比例，而沒(méi)有增加NKp46 + ILC3 中的比例（圖1 E）。這表明，GOB促進(jìn)NKp46^low 或 NKp46- ILC3中NKp46的表達(dá)。

鑒于 GOB 在共培養(yǎng)中維持 NKp46+ ILC3 比例的強(qiáng)大能力，因此表征杯狀細(xì)胞是否影響 ILC3 細(xì)胞因子譜。與 IL-22 結(jié)合時(shí)，ILC3 以亞群和刺激依賴性方式產(chǎn)生 IL-17 和 IFNγ。在非極化刺激條件下，與SIO共培養(yǎng)相比，GOB增加了IL-22+ 的比例，但沒(méi)有增加IL-17+ 或IFNγ+ ILC3（圖1 F-H），且IL-22在與GOB共培養(yǎng)的ILC3中表達(dá)增加（圖1 G）。

然后評(píng)估了杯狀細(xì)胞誘導(dǎo)的IL-22對(duì)上皮細(xì)胞的可能反饋。與SIO相比，與GOB共培養(yǎng)的ILC3中Il22轉(zhuǎn)錄物增加。同時(shí)，從 ILC3 共培養(yǎng)物中分離的 SIO 和 GOB IEC 中 IL-22 靶基因 Reg3g 的表達(dá)更高，且在受刺激的 GOB-ILC3 共培養(yǎng)中，Reg3g 在 IEC 中的表達(dá)最高（圖1 I）。這些結(jié)果表明，杯狀細(xì)胞維持NKp46+ 的表達(dá)并促進(jìn)IL-22的產(chǎn)生，從而反饋上調(diào)上皮保護(hù)屏障成分。

為了確定杯狀細(xì)胞對(duì) ILC3 表型的調(diào)控是否由可溶性因子介導(dǎo)，在物理分離類器官和 ILC3 的transwell 系統(tǒng)中建立了共培養(yǎng)（圖1 J）。與基質(zhì)共培養(yǎng)相比，SIO 和 GOB 共培養(yǎng)中 ILC3 的 IL-22 表達(dá)降低（圖1 K），表明物理接觸在上皮介導(dǎo)的ILC3衍生的IL-22調(diào)節(jié)中的重要性。通過(guò)來(lái)自mCherry-MUC2小鼠的 RORγtGFP ILC3和SIO 共培養(yǎng)的實(shí)時(shí)成像，檢測(cè)到ILC3和Muc2+ 細(xì)胞的共定位（圖1 L）。這些數(shù)據(jù)表明，ILC3 可能在體內(nèi)與杯狀細(xì)胞發(fā)生物理相互作用。

圖1    與富含SIO的杯狀細(xì)胞（GOB）共培養(yǎng)維持NKp46的表達(dá)，并增加ILC3中IL-22的產(chǎn)生。

由于Notch信號(hào)依賴于物理相互作用，實(shí)驗(yàn)假設(shè)系統(tǒng)中ILC3的上皮調(diào)節(jié)是由Notch通路驅(qū)動(dòng)的。Met分析證實(shí)杯狀細(xì)胞富集 Notch 配體 Delta-Like-Canonical-Notch-Ligand （Dll）1 和 Dll4 （圖2 A-C）。與常規(guī) SIO 相比，GOB 中 Dll1 和 Dll4 的表達(dá)增加 （圖2 D-F），Dll1 在 GOB 中富集，但未在 PAN中富集，這為 PAN 和 GOB 共培養(yǎng)中 IL-22 上調(diào)的差異提供了潛在機(jī)制（圖1 B-D）。

接下來(lái)，為了驗(yàn)證杯狀細(xì)胞衍生的Notch配體在調(diào)節(jié)ILC3衍生的IL-22中的重要性，在共培養(yǎng)前將GOB中Dll敲低（圖2 G），發(fā)現(xiàn)GOB中Dll1+ IEC的比例和Dll1蛋白表達(dá)的折疊變化降低（圖2 H-J），重要的是，從這些培養(yǎng)物中分離的 ILC3 的 Il22 表達(dá)顯著降低（圖2 K）。這些數(shù)據(jù)表明，上皮細(xì)胞，特別是杯狀細(xì)胞，是腸道中Notch配體的來(lái)源，以調(diào)節(jié)ILC3。

轉(zhuǎn)錄因子 T-bet 是 NKp46+ ILC3 亞群的發(fā)育和維持所必需的，雖然尚未確定，但Notch和T-bet在調(diào)節(jié)NCR+ ILC3方面存在交集。為了確定 T-bet 在Notch1介導(dǎo)的GOB上調(diào)IL-22中的作用，分析Notch1受體激活后產(chǎn)生的裂解的Notch1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD），量化了Notch1活性信號(hào)。結(jié)果表明，與GOB共培養(yǎng)時(shí)，T-bet+ ILC3中NICD+ IL-22+ 雙陽(yáng)性細(xì)胞的增加，但在T-bet+ ILC3中沒(méi)有增加（圖2 L-M）。通過(guò)GOB共培養(yǎng)，IL-22的蛋白表達(dá)和裂解的NICD豐度在T-bet+ ILC3中特異性增加（圖2 N-O）。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了Notch通路在調(diào)節(jié)ILC3功能中的關(guān)鍵亞群特異性作用，其中T-bet+ ILC3亞群對(duì)杯狀細(xì)胞衍生的Notch信號(hào)敏感，并通過(guò)IL-22 的生成作出響應(yīng)（圖2 P）。

圖2    杯狀細(xì)胞富集SIO （GOB）衍生的Notch配體Dll1在調(diào)節(jié)T-bet+ ILC3中起重要作用。

最后，研究人員考慮了 Notch 介導(dǎo)的 ILC3 和上皮細(xì)胞之間的相互作用對(duì)最初在轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)集中觀察到的分泌型細(xì)胞偏向分化的可能貢獻(xiàn)。Notch信號(hào)對(duì)腸上皮中分泌細(xì)胞和吸收細(xì)胞譜系的發(fā)育很重要，Notch的失活可抑制轉(zhuǎn)錄因子Atoh1。對(duì)小鼠 Atoh1 靶組的GSVA顯示，IEC + ILC3 中 Atoh1 和 Atoh1 靶基因顯著富集（圖3 A-C），在沒(méi)有 ILC3 的情況下將 IL-22 補(bǔ)充到類器官培養(yǎng)物中未發(fā)現(xiàn)相同程度的特征。用 10 ng/ml IL-22 處理 SIO 24 小時(shí)后，未發(fā)現(xiàn) Atoh1、Muc2、Tff3 或Lyz1 的 RT-qPCR 上調(diào)，但Fut2 和 Reg3g 上調(diào)（圖3 D）。這與最近使用細(xì)胞因子添加到SIO來(lái)描述杯狀細(xì)胞對(duì)IL-13和IL-22的二元反應(yīng)的發(fā)現(xiàn)是一致的。因此，實(shí)驗(yàn)假設(shè)了一種機(jī)制，即 ILC3 可能通過(guò)結(jié)合祖細(xì)胞上皮群體中的 Notch 配體來(lái)調(diào)節(jié)控制分泌型與吸收型分化（圖3 E）。

圖3     ILC3上調(diào)Notch介導(dǎo)的分泌譜系轉(zhuǎn)錄因子Atoh1的上皮轉(zhuǎn)錄特征。

圖4     圖形概要

總之，該研究報(bào)告，ILC3 誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞的全局轉(zhuǎn)錄變化，驅(qū)動(dòng)分泌型杯狀細(xì)胞特征的富集。研究發(fā)現(xiàn)富含杯狀細(xì)胞的 SIO 促進(jìn) NKp46+ ILC3 和 IL-22 的表達(dá)，這可以反饋誘導(dǎo) IL-22 介導(dǎo)的上皮轉(zhuǎn)錄特征。然而，該系統(tǒng)中 ILC3 的上皮調(diào)節(jié)是接觸依賴性的，并證明了上皮 Delta 樣典型Notch-配體（Dll）通過(guò)亞群特異性 Notch1 介導(dǎo)的 T-bet+ ILC3 激活，在驅(qū)動(dòng) ILC3 產(chǎn)生 IL-22 中的作用。最后，在SIO-ILC3共培養(yǎng)中通過(guò)干擾Notch配體-受體動(dòng)力學(xué)，ILC3似乎上調(diào)上皮Atoh1，從而影響分泌譜系決定。研究概述了腸上皮和ILC3之間的兩個(gè)互補(bǔ)的雙向信號(hào)模塊，它們可能與腸道穩(wěn)態(tài)和疾病有關(guān)。此外，該研究結(jié)果進(jìn)一步證明了類器官是研究上皮免疫相互作用的有力工具。該系統(tǒng)提供的精細(xì)實(shí)驗(yàn)控制量可以繼續(xù)發(fā)展我們對(duì)上皮-ILC 相互作用的詳細(xì)理解，以概述可能支持腸道穩(wěn)態(tài)并在臨床相關(guān)疾病中失調(diào)的機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：Read E, Pe?a-Cearra A, Coman D, Jowett GM, Chung MWH, Coales I, Syntaka S, Finlay RE, Tachó-Pi?ot R, van Der Post S, Naizi U, Roberts LB, Hepworth MR, Curtis MA, Neves JF. Bi-directional signaling between the intestinal epithelium and type-3 innate lymphoid cells regulates secretory dynamics and interleukin-22. Mucosal Immunol. 2024 Feb;17(1):1-12. doi: 10.1016/j.mucimm.2023.11.002. Epub 2023 Nov 10. PMID: 37952849; PMCID: PMC7615753.

Impact Factor    7.9

Online ISSN: 1935-3456Linking ISSN: 1933-0219

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