RPL35 downregulated by mechanical overloading promotes chondrocyte senescence and osteoarthritis development via Hedgehog-Gli1 signaling

Keywords: Chondrocyte; Hedgehog pathway; Osteoarthritis; Ribosomal protein L35; Senescence.

骨關節(jié)炎（OA）的特征是關節(jié)軟骨退行性改變和受累關節(jié)軟骨基質丟失，導致慢性疼痛、運動受限，最終降低生活質量。關節(jié)軟骨主要由軟骨細胞和細胞外基質（ECM）組成，其退變降解的過程主要由一系列軟骨基質降解酶所介導。細胞衰老是與ECM降解和軟骨細胞功能障礙密切相關的另一個因素。在病理狀態(tài)下，軟骨細胞可能會去分化，失去其功能表型，并趨向衰老。在培養(yǎng)過程中，軟骨細胞衰老和去分化伴隨著軟骨細胞特異性蛋白（如II型膠原和糖蛋白）表達的降低。

軟骨細胞維持軟骨組織形態(tài)，對機械刺激是非常敏感的。生理范圍內的機械負荷對于維持軟骨細胞穩(wěn)態(tài)是必要的。然而，由肥胖、關節(jié)不穩(wěn)定、勞損或創(chuàng)傷引起的異常負荷可導致軟骨退變，并且是與骨關節(jié)炎發(fā)展相關的重要危險因素。

核糖體蛋白在機體的生長發(fā)育以及細胞穩(wěn)態(tài)的調節(jié)中起著關鍵作用。既往研究表明，lncNB1通過結合核糖體蛋白L35（RPL35）誘導神經母細胞瘤細胞的增殖和存活，而高水平的RPL35與腫瘤預后相關。RPL35作為核糖體60s的小亞基在蛋白質合成中起著至關重要的作用，如RPL35通過RPL35/ERK/HIF1α軸上調HIF1α促進有氧糖酵解。

基于此，廣東省骨與關節(jié)退行性疾病重點實驗室的科研團隊在最近的一項研究中詳細闡述了機械應力與細胞衰老之間的關系，并確定了 RPL35 蛋白表達的降低在過度機械應力促進的軟骨細胞衰老中起著關鍵介質的作用。該研究表明，外源性添加 RPL35 可以減輕應力負荷誘導的Hedgehog（Hh）通路的激活。這表明關節(jié)內注射 RPL35 可作為 OA 治療方法的潛力。研究成果發(fā)表在 Journal of Orthopaedic Translation 期刊題為“RPL35 downregulated by mechanical overloading promotes chondrocyte senescence and osteoarthritis development via Hedgehog-Gli1 signaling"。

過度機械負荷被認為是研究骨關節(jié)炎生理特征的良好模型，為了鑒定機械負荷后對軟骨細胞的重要基因，施加 5%、10% 或20% 的0.5 Hz循環(huán)拉伸應力24小時，并進行 RNA 測序分析。差異表達分析揭示了459個差異表達的基因。與正常軟骨細胞相比，過度機械負荷（20%）處理的軟骨細胞中RPL35 基因表達表現(xiàn)出下調。進一步驗證RPL35與過度機械負荷處理的軟骨細胞之間的關聯(lián)，發(fā)現(xiàn)過度機械應力不僅促進了分解代謝效應，而且刺激了軟骨細胞衰老。

已知促炎細胞因子，如IL-1β和TNF-β，在OA的發(fā)病機制中起作用。因此，使用重組 IL-1β 刺激的原代小鼠軟骨細胞建立了 OA 模型，WB結果顯示，與正常軟骨細胞相比，IL-1β刺激的軟骨細胞中RPL35降低。這些數(shù)據(jù)表明，過度機械負荷誘導體外衰老軟骨細胞中RPL35下調。

為了評估體外研究結果是否可以在體內應用，構建機械性超負荷引起的OA，將右膝關節(jié)給予60次 4、9和13.5 N的軸向壓縮負荷，在人 OA 中檢測了 RPL35 蛋白水平。IHC染色結果顯示，與輕度損傷的外側脛骨平臺軟骨樣本相比，接受全膝關節(jié)置換術的OA患者脛骨平臺內側RPL35蛋白水平降低（圖1 A、B）。當使用膝關節(jié)承受0.5 N的靜態(tài)軸向壓縮負荷10 分鐘的OA小鼠模型時觀察到相同的結果，即與正常軟骨相比，RPL35 蛋白水平在 OA 小鼠中呈現(xiàn)進行性下調，并伴有軟骨損傷增加（圖1 C-E）。進一步分析機械負荷對關節(jié)軟骨衰老的影響，在 13.5 N 的機械壓縮作用2-4周后，發(fā)現(xiàn)小鼠關節(jié)軟骨細胞中MMP13-、P16- 和P21- 陽性軟骨細胞的數(shù)量增加，Col2- 陽性軟骨細胞的數(shù)量顯著減少。這表明，機械超負荷加速了關節(jié)軟骨中的軟骨細胞衰老。

番紅O 染色顯示，在 13.5 N 的峰值壓縮負荷下持續(xù)多次刺激 2 或 4 周可誘導小鼠膝關節(jié)蛋白多糖的丟失。然而，在 4 N 和 9 N 的刺激下，軟骨細胞沒有顯著變化（圖1 F、G）。IHC 軟骨染色同樣證實，在施加 13.5 N 的過大機械壓縮后，軟骨細胞 RPL35 蛋白水平顯著下降（圖1 F-K）。這些發(fā)現(xiàn)揭示了 RPL35 蛋白水平隨著 OA 的進展而降低，表明 OA 嚴重程度與 RPL35 表達之間存在關聯(lián)。

圖1   軟骨細胞RPL35水平因機械超負荷而降低，OA關節(jié)軟骨的RPL35水平下降。

接下來，通過敲低 RPL35以探索其在 OA 進展中的作用，評估了RPL35的缺失是否驅動原代小鼠軟骨細胞的退變。結果顯示，RPL35敲低降低了Col2水平，增加了MMP13、P16和P21的水平。此外，還通過關節(jié)注射研究了 RPL35 在體內的作用，觀察到體內敲低 RPL35 后軟骨細胞中 RPL35 的表達顯著降低，且這種降低伴隨著軟骨的退行性變化。在關節(jié)軟骨承受過大機械應力的小鼠中也觀察到了類似現(xiàn)象，但并未觀察到其敲低加劇了骨關節(jié)炎的進展。

然后，通過過表達RPL35以探索其對軟骨細胞穩(wěn)態(tài)的影響，構建RPL35過表達（Ad-RPL35）和陰性對照（Ad-NC）載體。在關節(jié)內注射 Ad-RPL35 的機械負荷小鼠中，與接受機械負荷和 Ad-NC 處理的小鼠相比，OA 的嚴重程度顯著降低，且未觀察到軟骨損傷。有趣的是，IHC結果顯示，RPL35表達的變化與上述分析的關節(jié)軟骨損傷程度的變化趨勢一致（圖2 A）。此外，與對照組相比，機械負荷處理4-6周的小鼠中，MMP13-、P16-和P21- 陽性軟骨細胞的數(shù)量增加，而Col2- 陽性軟骨細胞的數(shù)量顯著減少。RPL35 的添加緩解了退行性病變（圖2 B）。此外，過度的機械負荷刺激促進了這些衰老因子的表達，而 RPL35 的添加在體外逆轉了這些效應（圖2 C、D），表明其對軟骨細胞衰老的保護作用。

圖2   RPL35在軟骨細胞中的過表達可防止機械誘導的軟骨細胞衰老和OA發(fā)展。

最后，研究人員試圖確定哪種信號通路負責RPL35 敲低后誘導軟骨細胞衰老。因此，鑒定了 4989 個轉錄本，發(fā)現(xiàn)上調的轉錄本大部分在 Hedgehog（Hh）通路中富集。qPCR結果顯示，敲低RPL35或過度機械負荷導致軟骨細胞GLI-1和SMO表達增加，它們是 Hh 通路激活的標志物。IHC 和 IF 均表明，在過度機械負荷下軟骨中 SMO、Gli-1 和 PTCH1 Hh 信號增加，而添加 RPL35 恢復了 SMO、Gli-1 和 PTCH1 的表達。這些結果說明了RPL35對Hh通路的抑制作用。

此外，還確定了 Hh 的激活是否有助于 RPL35 缺失誘導的軟骨細胞衰老，發(fā)現(xiàn)在原代小鼠軟骨細胞中，Hh 通路抑制劑環(huán)巴胺（Cyclopamine）部分降低了 RPL35 缺失誘導的 P21、P16 和 MMP13 的蛋白表達水平。上述結果表明，Hh通路激活升高至少在一定程度上導致了RPL35缺失引起的關節(jié)軟骨退化。

通路分析顯示，與正常軟骨細胞相比，用RPL35 siRNA處理的原代軟骨細胞中，有17個上調的轉錄本介導Hh信號通路，其中酪蛋白激酶1ε（CK1ε）是突出的（圖3 A、B）。qPCR和WB分析顯示，軟骨細胞中RPL35的敲低提高了內源性CK1ε水平（圖3 C）。此外，在過度機械負荷處理的軟骨細胞中也觀察到 CK1ε 水平升高，而添加 RPL35 恢復了 CK1ε 的表達 （圖3 D）。IF染色分析也觀察到相同的趨勢（圖3 E）。

因此，探討了CK1ε在OA發(fā)展中的作用。與正常軟骨細胞相比，CK1ε 過表達的軟骨細胞 MMP13 水平升高、Col2 水平降低以及衰老相關標志物 P16 和 P21 水平升高，而敲低CK1ε 則具有保護作用（圖3 F）。此外，還探索了siRPL35是否通過靶向CK1ε/SMO信號來調控OA過程，WB結果表明，RPL35敲低的影響被CK1ε敲低顯著減弱（圖3 G）。此外，RPL35 敲低后 CK1ε 水平升高，并與 SMO 共定位增加（圖3 H），進一步提示了CK1ε激活SMO的可能性。總之，這些數(shù)據(jù)表明，抑制RPL35 可導致 OA，可能是通過提高 CK1ε 蛋白水平，從而與 SMO接觸激活，最終激活 Hh 通路。

圖3    RPL35 通過 Csnk1e（CK1ε）調節(jié) Hh 信號轉導活性。

圖4     圖形概要

綜上所述，該研究明確了RPL35和CK1ε在OA中的作用和聯(lián)系，實驗結果驗證了CK1ε在關節(jié)軟骨中的過表達激活了Hh通路，表明RPL35的缺失和CK1ε-Hh信號通路的激活在生物力學誘導的軟骨細胞衰老和退變中起著關鍵作用。因此，靶向關節(jié)內補充 RPL35 是減緩 OA 發(fā)展的一種方式。

參考文獻：Zhu J, Liu L, Lin R, Guo X, Yin J, Xie H, Lu Y, Zhang Z, Zhang H, Yao Z, Zhang H, Wang X, Zeng C, Cai D. RPL35 downregulated by mechanical overloading promotes chondrocyte senescence and osteoarthritis development via Hedgehog-Gli1 signaling. J Orthop Translat. 2024 Apr 1;45:226-235. doi: 10.1016/j.jot.2024.01.003. PMID: 38596341; PMCID: PMC11001632.

Impact Factor  5.9

Print ISSN: 2214-031X

Online ISSN: 2214-0328

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