The TNFSF12/TWEAK Modulates Colonic Inflammatory Fibroblast Differentiation and Promotes Fibroblast-Monocyte Interactions

KWS：TNFSF12/TWEAK；Colonic Inflammatory Fibroblast；Differentiation；Monocyte；Cell Coculture

炎癥性腸病（IBD）是潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和克羅恩?。–D）兩種病癥的總稱，在不同的疾病階段和致病性情況下均發(fā)現(xiàn)了炎癥成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞特征和功能的改變成為 IBD 的關(guān)鍵影響因素，驅(qū)動致病性成纖維細(xì)胞功能的介質(zhì)可能是治療干預(yù)的希望靶點(diǎn)。

驅(qū)動成纖維細(xì)胞-免疫細(xì)胞通訊的介質(zhì)和分子機(jī)制才剛開始被闡明。TNF 超家族（TNFSF）成員14（TNFSF14），也稱為 LIGHT，被鑒定為一種成纖維細(xì)胞衍生因子，會抑制腸道類器官的生長。重要的是，TNFSF 的各種因子，包括TNFSF14、TNFSF12（也稱為 TNF 相關(guān)的凋亡弱誘導(dǎo)劑TWEAK）或 TNFSF15 ，最近在臨床前模型中確認(rèn)與 IBD 和纖維化有關(guān)。

基于此，愛爾蘭都柏林大學(xué)學(xué)院Conway生物分子與生物醫(yī)學(xué)研究所的聯(lián)合團(tuán)隊在一項研究中，集中探討了 TWEAK 作為結(jié)腸成纖維細(xì)胞分化介質(zhì)的潛力，并分析了其在成纖維細(xì)胞-單核細(xì)胞相互作用中的參與。研究發(fā)現(xiàn)TWEAK 具有作為轉(zhuǎn)錄抑制因子和誘導(dǎo)因子的雙重作用，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞分化為炎癥細(xì)胞，并利用共培養(yǎng)模型探索了炎性成纖維細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞反應(yīng)的潛力，發(fā)現(xiàn)暴露于 TWEAK 處理的人結(jié)腸成纖維細(xì)胞的 THP-1 單核細(xì)胞粘附并增加炎癥標(biāo)志物的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明了 TWEAK 促進(jìn)結(jié)腸炎性成纖維細(xì)胞分化和成纖維細(xì)胞-單核細(xì)胞相互作用。研究成果發(fā)表于 The Journal of Immunology 期刊題為“The TNFSF12/TWEAK Modulates Colonic Inflammatory Fibroblast Differentiation and Promotes Fibroblast-Monocyte Interactions"。

首先，為了測試 TWEAK 在結(jié)腸成纖維細(xì)胞分化中的作用，將原代人結(jié)腸成纖維細(xì)胞用 TWEAK 處理評估轉(zhuǎn)錄譜的變化。差異表達(dá)基因揭示了超過1200 基因的失調(diào)，而 TWEAK 作為基因誘導(dǎo)因子和抑制因子的作用相似，有 692 個誘導(dǎo)基因和 579 個抑制基因，其中上調(diào)的轉(zhuǎn)錄組由與炎癥相關(guān)的基因填充（圖1 A）。

值得注意的是，與抗原（Ag）呈遞相關(guān)的幾個過程，如 TAP1 結(jié)合和 MHC 蛋白結(jié)合，也在 TWEAK 上調(diào)數(shù)據(jù)集中富集，還上調(diào)了許多參與 Ag 加工和呈遞以及對感染因子反應(yīng)的基因（圖1 B、D）。同時，TWEAK 促進(jìn)了細(xì)胞因子（包括 IL-1B、IL-6、IL-12A、IL-15 或 IL-33）、趨化因子、免疫受體、TNFSF 介質(zhì)/受體/接頭、細(xì)胞粘附分子的基因表達(dá)（圖1 C）。TWEAK 還誘導(dǎo)了基質(zhì)重塑介質(zhì)和炎性成纖維細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，降低血小板衍生生長因子受體α（PDGFRα）的表達(dá)（圖1 E）。這些數(shù)據(jù)表明，TWEAK 介導(dǎo)結(jié)腸成纖維細(xì)胞分化為不同的致病特征，促進(jìn)參與炎癥和 Ag 呈遞的基因的表達(dá)，增加參與基質(zhì)重塑的基因，并可能使參與上皮穩(wěn)態(tài)的基因失調(diào)。

以往研究將結(jié)腸基質(zhì)細(xì)胞分為四類，其中基質(zhì)4（S4）亞群被確定為炎癥群體，該亞群在正常結(jié)腸標(biāo)本中幾乎不存在，而在 UC 活檢中增加。鑒于結(jié)腸成纖維細(xì)胞中 TWEAK 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組的炎癥性質(zhì)，研究人員假設(shè)這類似于先前在 UC 中鑒定的 S4 亞群。為此，展開了一項比對研究，將 TWEAK 上調(diào)和下調(diào)的轉(zhuǎn)錄組與這四個基質(zhì)群體中的每一個進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)TWEAK 誘導(dǎo)的反應(yīng)與 S4 的同源性最高。與先前在 IBD 患者活檢中報道的 TWEAK 受體（TNFRSF12/Fn14）的高表達(dá)一致，對 Fn14 在細(xì)胞群中的表達(dá)分析表明，該基因在 S4 細(xì)胞中dute存在，而 TWEAK 本身不被任何基質(zhì)群表達(dá)。因此，TWEAK 在結(jié)腸成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)炎癥轉(zhuǎn)錄程序，該程序與 UC 中的炎性成纖維細(xì)胞亞群部分一致。

圖1   TWEAK誘導(dǎo)結(jié)腸成纖維細(xì)胞的炎癥譜。

鑒于 TWEAK 介導(dǎo)的 ICAM-1 和 VCAM-1 上調(diào)，以及 CCL2 的高分泌，實驗假設(shè) TWEAK 誘導(dǎo)的炎性成纖維細(xì)胞促進(jìn)單核細(xì)胞募集或激活。

接下來，為了研究它們的相互作用，將原代結(jié)腸成纖維細(xì)胞與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)，單培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞（vehicle- 或TWEAK-）作為對照。與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)導(dǎo)致大量 THP-1 細(xì)胞粘附，從而形成兩個細(xì)胞組分，以下稱為懸浮和粘附組分（圖2 A）。有趣的是，與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)上調(diào)懸浮 THP-1 細(xì)胞中粘附分子 CD11b的表達(dá)，表明該細(xì)胞組分也由與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)引發(fā)，盡管這僅通過用 TWEAK 預(yù)處理而略微增加（圖2 B、C）。相反，THP-1 細(xì)胞的活力不受 TWEAK 的影響，且在單培養(yǎng)和共培養(yǎng)之間沒有差異。

然后繼續(xù)分析了 TWEAK 誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞對極化募集的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的可能性。CD14 是一種在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的標(biāo)志物，在單培養(yǎng)懸浮的 THP-1 細(xì)胞中表達(dá)極少，相反，在共培養(yǎng)物的懸浮 THP-1 中 CD14^high 細(xì)胞顯著增加，這在與 TWEAK 處理的成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)物中進(jìn)一步富集（圖2 D、E）。有趣的是，CD14 表達(dá)也在暴露于 TWEAK 處理的結(jié)腸成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基的 THP-1 細(xì)胞中被誘導(dǎo)，但程度低于直接共培養(yǎng)（圖2 E）。此外，與 TWEAK 處理的成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞中，ICAM-1^high THP-1 的頻率更高（圖2 F、G），熱圖分析還顯示ICAM-1^high 和 CD14^high  THP-1 之間存在相關(guān)性（圖2 F）。

進(jìn)一步分析 THP-1 的貼壁部分，使用 CCR2 （在 THP-1 上高表達(dá)，在結(jié)腸成纖維細(xì)胞上缺失）和 CD90 （成纖維細(xì)胞標(biāo)志物，在THP-1 上缺失）來區(qū)分粘附共培養(yǎng)中的兩個細(xì)胞組分（圖2 H）。實驗觀察到，與具有 CCD-18Co（圖2 H、I）和 PB-H-6231的正常結(jié)腸成纖維細(xì)胞相比，TWEAK 處理的成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)中粘附 CCR2^high CD90^- 細(xì)胞（原始巨噬細(xì)胞）數(shù)量顯著增加，表明 TWEAK 刺激促進(jìn)了成纖維細(xì)胞募集和粘附單核細(xì)胞的能力。有趣的是，與懸浮部分中的 THP-1 一樣，粘附的 CCR2^high CD90^- 細(xì)胞的 CD14 水平明顯更高（圖2 J、K）。同樣，盡管 TWEAK 在 THP-1 或成纖維細(xì)胞單培養(yǎng)物中未能上調(diào) CXCL1 或 IL-8 的分泌，但與未處理的成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)相比，THP-1/TWEAK 誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)物中兩種趨化因子均顯著增加（圖2 L）。這些數(shù)據(jù)表明，THP-1 細(xì)胞與結(jié)腸成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)可促進(jìn)其粘附、活化和趨化因子分泌，當(dāng)用 TWEAK 預(yù)刺激成纖維細(xì)胞時，這種效應(yīng)會增強(qiáng)。

圖2   TWEAK 誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞募集并極化 THP-1 細(xì)胞。

發(fā)現(xiàn) TWEAK 處理的結(jié)腸成纖維細(xì)胞促進(jìn) THP-1 粘附和分化后，又研究了原代單核細(xì)胞是否會表現(xiàn)出類似的反應(yīng)，使用上述共培養(yǎng)模型，將原代單核細(xì)胞與結(jié)腸成纖維細(xì)胞進(jìn)行單培養(yǎng)或共培養(yǎng)。與 THP-1 相反，觀察到大多數(shù)單核細(xì)胞粘附在培養(yǎng)物中，無論是否存在成纖維細(xì)胞。培養(yǎng) 24 小時后，單培養(yǎng)單核細(xì)胞中 CCR2 的表達(dá)明顯高于共培養(yǎng)，而在與  TWEAK處理的成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)中CCR2 的表達(dá)zuidi，這可能代表一種單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞中介。

中度和高度表達(dá) CD16 的單核細(xì)胞的頻率比較顯示，與單獨(dú)的單核細(xì)胞相比，TWEAK 刺激的成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)的原代單核細(xì)胞從 CD16^high 相對轉(zhuǎn)變?yōu)?CD16^int（表示為 CD16^int/CD16^high 的比率）。此外，與正常成纖維細(xì)胞相比，TWEAK 處理的成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)中 TREM-1^high （結(jié)腸炎模型和 CD 患者中致病性巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物）單核細(xì)胞的頻率顯著增加。這些數(shù)據(jù)表明，TWEAK 處理的成纖維細(xì)胞促進(jìn)原代單核細(xì)胞分化和活化，表現(xiàn)為CCR2 和 CD16 表達(dá)的降低、TREM-1 表達(dá)的增加以及 CXCL1 和 CXCL10 趨化因子分泌的增加。

最后，研究人員對 TWEAK/S4 共同轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了額外的String分析，重點(diǎn)關(guān)注信號傳導(dǎo)介質(zhì)、細(xì)胞因子和趨化因子（圖3 A）。信號介質(zhì)包括非經(jīng)典 NF-κB RELB 和 NFKB2 的兩個主要效應(yīng)子，發(fā)現(xiàn) TWEAK 在蛋白質(zhì)水平上誘導(dǎo)非經(jīng)典 NF-κB 前體 p100 裂解成 p52，從 4 小時開始，在 24-48 小時之間達(dá)到峰值（圖3 B）。

鑒于上述發(fā)現(xiàn)，測試了非經(jīng)典 NF-κB 信號的選擇性抑制是否可以消除 TWEAK 誘導(dǎo)的結(jié)腸成纖維細(xì)胞的炎癥分化。實驗發(fā)現(xiàn)，用 NIK 抑制劑 SMI1 處理阻斷了 TWEAK 介導(dǎo)的 VCAM-1 表達(dá)上調(diào)（圖3 C）和 CCL2 分泌（圖3 D），但它不影響 ICAM-1（圖3 C），這表明對 TWEAK 的反應(yīng)可能由多種信號通路協(xié)調(diào)。

此外，研究人員假設(shè)，抑制 TWEAK 介導(dǎo)的非經(jīng)典 NF-κB 信號可以調(diào)節(jié)結(jié)腸成纖維細(xì)胞和單核細(xì)胞之間的相互作用，阻斷后者的炎癥極化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用 NIK SMI1 處理成纖維細(xì)胞時，CD14^high THP-1 細(xì)胞群在與 TWEAK 誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)中減少（圖3 E、F），與正常結(jié)腸成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)中的水平相似，表明NIK 抑制劑至少部分損害了 TWEAK 誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞極化 THP-1 細(xì)胞的能力。這些數(shù)據(jù)表明，TWEAK通過非典型NF-κB介導(dǎo)結(jié)腸成纖維細(xì)胞炎癥分化和單核細(xì)胞極化。

圖3    非經(jīng)典 NF-κB 調(diào)節(jié) TWEAK 引發(fā)的成纖維細(xì)胞和單核細(xì)胞之間的相互作用。

圖4    圖形概要

TNFSF12/TWEAK 誘導(dǎo)結(jié)腸成纖維細(xì)胞的炎癥特征。TWEAK 處理的成纖維細(xì)胞促進(jìn)單核細(xì)胞粘附和炎性極化。抑制非經(jīng)典 NF-κB 通路部分阻斷了這種相互作用。

綜上所述，該研究提供的數(shù)據(jù)揭示了 TWEAK 作為結(jié)腸成纖維細(xì)胞炎癥分化介質(zhì)的重要作用，誘導(dǎo)與先前在 UC 患者中發(fā)現(xiàn)的炎癥成纖維細(xì)胞一致的轉(zhuǎn)錄程序。通過細(xì)胞系、原代單核細(xì)胞和共培養(yǎng)模型，研究發(fā)現(xiàn) TWEAK 刺激的結(jié)腸成纖維細(xì)胞促進(jìn)單核細(xì)胞的粘附和分化，改變關(guān)鍵炎癥標(biāo)志物如 CD14、CD16 或 TREM-1 的表達(dá)，并增強(qiáng)炎癥趨化因子的分泌。這項研究將 TWEAK/Fn14 軸定位為腸道炎癥中成纖維細(xì)胞-單核細(xì)胞相互作用的新興調(diào)節(jié)因子，以及調(diào)節(jié) IBD 中致病性成纖維細(xì)胞功能的有吸引力的治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：Matellan C, Kennedy C, Santiago-Vela MI, Hochegger J, Ní Chathail MB, Wu A, Shannon C, Roche HM, Aceves SS, Godson C, Manresa MC. The TNFSF12/TWEAK Modulates Colonic Inflammatory Fibroblast Differentiation and Promotes Fibroblast-Monocyte Interactions. J Immunol. 2024 Jun 15;212(12):1958-1970. doi: 10.4049/jimmunol.2300762. PMID: 38700420; PMCID: PMC11149899.

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