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己烯雌酚殘留酶聯(lián)免疫檢測方法以及檢測設(shè)備

閱讀:223        發(fā)布時間:2016-4-19

豬肉中己烯雌酚殘留檢測方法-

酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)

豬肉中己烯雌酚殘留檢測方法-

酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)
 

范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬肉中己烯雌酚殘留量檢測的制樣和酶聯(lián)免疫吸附測定法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬肉中己烯雌酚的殘留量的快速篩選檢測。對于可疑樣品需用確證法確認。

規(guī)范性引用文件

下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件,其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn),然而,鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的版本。凡是不注日期的引用文件,其版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

GB/T 1.1-2000 標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分:標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則 (ISO/IEC Directives, Part 3, 1997, Rules for the structure and drafting of International Standards, NEQ)

GB/T 6682-1992  分析實驗室用水規(guī)則和試驗方法

農(nóng)牧發(fā)[2003]1號  獸藥殘留試驗技術(shù)規(guī)范(試行)

制樣

樣品的制備

取適量新鮮或冷凍的空白或供試豬肉組織,絞碎并之使均勻,密封。

樣品的保存

-20以下冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/span>

測定方法

方法提要或原理

豬肉中殘留的己烯雌酚用叔丁基甲基醚提取,酶聯(lián)免疫吸附測定法測定,其基本原理是抗原抗體反應(yīng)。酶標(biāo)板的微孔包被有偶聯(lián)抗原,標(biāo)樣或樣品中的己烯雌酚與微孔中預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭己烯雌酚特抗體。通過洗滌除去沒有與特異性抗體結(jié)合的酶標(biāo)記抗原。加入底物液,結(jié)合到板上的酶標(biāo)記物將底物轉(zhuǎn)化為有色產(chǎn)物。加入終止液,在450nm處測定吸光度值,吸光度值與試樣中己烯雌酚濃度呈反比。

試劑和材料

以下所用的試劑,除特別注明者外均為分析純試劑;水為符合GB/T 6682規(guī)定的二級水。  

叔丁基甲基醚

乙腈

正己烷

己烯雌酚試劑盒(采用*備案的試劑盒)

4.2.6.1  己烯雌酚系列標(biāo)準(zhǔn)溶液  0ng/mL 、0.1ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL8.1ng/mL

4.2.6.2  酶標(biāo)板  8×12孔,包被有偶聯(lián)抗原

4.2.6.3  酶標(biāo)記物

4.2.6.4  己烯雌酚抗體 臨用前將抗體用稀釋了的復(fù)溶液按111倍稀釋(50mL抗體加500mL復(fù)溶液)成的己烯雌酚抗體溶液

4.2.6.5  底物溶液A

4.2.6.6  底物溶液B

4.2.6.7  濃縮洗滌液 臨用前用水將其稀釋20倍作為洗滌液

4.2.6.8  濃縮復(fù)溶液 臨用前用水將其稀釋5倍作為稀釋了的復(fù)溶液

4.2.6.9  終止溶液

儀器和設(shè)備

CSY-E96Y己烯雌酚殘留檢測儀

天平  感量0.01g

分析天平 感量0.00001g

漩渦混合儀

振蕩器

組織勻漿機

冷凍離心機

氮吹儀

離心管  20mL、50mL

微量移液器  單道20mL50mL,100mL,1000mL;多道50250mL  

測定步驟

試料的制備

試料的制備包括:

  • 取絞碎后的供試樣品,作為供試試料。
  • 取絞碎后的空白樣品,作為空白試料。
  • 取絞碎后空白樣品,添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,作為空白添加試料。

提取和凈化

 10000r/min勻漿1min的試料(5±0.05g,置50mL離心管中,加15mL叔丁基甲基醚,渦旋1min,振蕩10min6000r/min,在-4℃下離心10min,將上層清夜移至雞心瓶中。再加15mL叔丁基甲基醚同法操作,合并兩次上清液,于45℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。

2mL乙腈于雞心瓶中,旋渦溶解殘留物,然后將其轉(zhuǎn)移至20mL離心管中,再加2mL乙腈同法操作,轉(zhuǎn)移至同一離心管中。在離心管中加5mL正己烷,渦動60s,15℃,6000 r/min下離心5min,棄去上層液體,再加5mL正己烷于離心管中同法操作,取下層液體,60℃下氮氣吹干,加入1mL稀釋后的復(fù)溶液,渦動60s后取50mL加入200mL稀釋后的復(fù)溶液,渦動60s,即可作為試樣供分析。

樣品測定程序(20℃~26℃條件下操作)

4.4.3.1  使用前將試劑盒置于室溫(20℃~26℃)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的酶標(biāo)板微孔條插入框架中,將不用的微孔條放入自封袋,保存于2℃~8℃。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,每個樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均需做兩個平行實驗。

4.4.3.2  加入50 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液或試樣溶液到微孔底部,每孔再加入50 mL己烯雌酚抗體溶液,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜封板,25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。

4.4.3.3  倒出孔中液體,將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上拍打,去除孔中液體。每孔加入250mL洗滌液,10s后倒出孔中液體,用吸水紙拍干,如此重復(fù)操作共洗板5次。

4.4.3.4  加入100mL酶標(biāo)記物到微孔底部,用蓋板膜封板,25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。取出酶標(biāo)板,如前述洗板5次。

4.4.3.5  加入50mL底物液A50mL底物液B到微孔中,輕輕振蕩混勻,25℃環(huán)境避光顯色15min

4.4.3.6  加入50mL終止液到微孔中,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處,測定每孔吸光度值(OD值)。

結(jié)果計算和表述

所獲得的標(biāo)準(zhǔn)或樣品吸光度值的平均值除以*個標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))吸光度值的平均值再乘以100%

得到以百分比給出的吸光度值,以式(1.1)表示:

 

B

——

B0

 

 

 

 

百分吸光度值=        ×100%  ………………………………………………………  1.1    

 

 

式中:

B—為標(biāo)準(zhǔn)溶液或供試樣品的平均吸光度值;

B0為零濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。

 

以標(biāo)準(zhǔn)溶液中己烯雌酚濃度(ng/mL)的自然對數(shù)為X軸,百分吸光度值為Y軸,在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。相對應(yīng)的供試樣品的濃度(ng/mL)可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出。也可以求出回歸曲線的方程,計算未知樣品中己烯雌酚的濃度。如果有專業(yè)計算機軟件可直接求出供試樣中己烯雌酚的濃度。

注:檢測結(jié)果小于1.0μg/ kg時,可判為未檢出,大于1.0μg/ kg時,判為可疑,需用確證法確認。

檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度

靈敏度

本方法在豬肉中的zui低檢出限為1.0μg/kg。

準(zhǔn)確度

本方法在豬肉中1.0μg/kg4.0μg/kg添加濃度的回收率為60.0%120.0%

精密度

本方法的批內(nèi)變異系數(shù)CV22%; 批間變異系數(shù)CV15%

己烯雌酚殘留檢測儀技術(shù)參數(shù):

☆波長范圍:300nm-1000nm

☆波長準(zhǔn)確度:±2nm

☆吸光度范圍: 0.000~4.000ABS

☆分辨率 :0.001Abs

☆穩(wěn)定性 : ±0.001A/hr

☆透射比重復(fù)性: ≤0.5%T

☆光源 : 進口LED

☆樣品池 : 微孔板

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