Western免疫印跡技術(shù)大匯總（上）

時(shí)間：2021/8/12閱讀：1385

各位小伙伴們，我們又見(jiàn)面了

好久沒(méi)有更新一些技術(shù)性的文章了，今天我們就來(lái)講講蛋白質(zhì)技術(shù)，對(duì)，沒(méi)錯(cuò)，就是Western免疫印跡，這個(gè)實(shí)驗(yàn)相信各位小伙伴們，也是耳熟能詳了，但是呢，還是有不少下伙伴們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中，會(huì)出現(xiàn)各種各樣的問(wèn)題，所以為了解惑各位小伙伴們，今天我們就出一期關(guān)于Western免疫印跡實(shí)驗(yàn)的知識(shí)點(diǎn)，其中包括它的概念、原理、應(yīng)用場(chǎng)景、操作步驟以及注意事項(xiàng)等。

Western免疫印跡是什么

Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過(guò)融合部分的抗體檢測(cè)。

Western免疫印跡原理

與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，探針是抗體，顯色用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。

Western免疫印跡應(yīng)用場(chǎng)景

■ 從蛋白質(zhì)混合物中檢出目標(biāo)蛋白質(zhì)；

■ 定量或定性確定細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)情況；

■ 用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA相互作用后續(xù)分析。

Western免疫印跡操作步驟

Western操作步驟一共分為八大步驟，在這里呢，我就簡(jiǎn)單向大家介紹大致的步驟，為了出于嚴(yán)謹(jǐn)性，我們將在下一期為大家專門介紹操作步驟的詳細(xì)介紹。

八大步驟：

一、試劑的準(zhǔn)備

二、蛋白樣品制備

三、蛋白含量的測(cè)定

四、SDS－PAGE電泳

五、轉(zhuǎn)膜

六、免疫反應(yīng)

七、化學(xué)發(fā)光，顯影，定影

八、凝膠圖象分析

Western免疫印跡注意事項(xiàng)

1. 一抗、二抗的稀釋度、作用時(shí)間和溫度對(duì)不同的蛋白要經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳條件。

2. 顯色液必須新鮮配置使用，最后加入H2O2。

3. DAB有致癌的潛在可能，操作時(shí)要小心仔細(xì)

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