知無不“研“ | ChIP實驗基礎(chǔ)攻略

時間：2021/10/14閱讀：3700

對一個實驗室新手來講，提到ChIP，您可能沒聽過這個詞，他的全稱叫染色質(zhì)免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation),今天就帶大家來學(xué)習(xí)一下CHIP實驗的相關(guān)知識，咱們主要從CHIP的定義、原理、步驟以及應(yīng)用以下幾點給大家分析介紹，希望能幫助大家更好的做CHIP實驗

什么叫ChIP？

染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）用于分析基因組中特定染色體區(qū)域中組蛋白乙?；癄顟B(tài)的實驗方法，被用來研究細(xì)胞內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用。是目前確定與特定蛋白結(jié)合的基因組區(qū)域或確定與特定基因組區(qū)域結(jié)合的蛋白質(zhì)的最好方法。

ChIP的原理？

在活細(xì)胞狀態(tài)下，通過甲醛固定DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物后，采用微球菌核酸酶（Micrococcal Nucleas）（注：早期使用的超聲已經(jīng)被淘汰了，不推薦使用）隨機切斷DNA，形成一個個一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，隨后通過抗原-抗體特異性結(jié)合反應(yīng)富集、沉淀這些小片段，然后通過對NaC、蛋白酶K解除蛋白質(zhì)和DNA的交聯(lián)，分離蛋白，純化DNA，最后采用PCR檢測DNA的序列信息，獲取更多信息。

從上面的原理就可以看出，ChIP實驗步驟大致可分6步：

（1）1%甲醛處理使蛋白質(zhì)與 DNA 交聯(lián) ；

（2）細(xì)胞裂解，采用微球菌核酸酶消化形成染色質(zhì)小片段；

（3）抗原-抗體反應(yīng)，促進免疫沉淀反應(yīng)；

（4）NaCl、蛋白酶 K 處理，解除DNA-蛋白交聯(lián)；

（5）DNA 純化回收；

（6）采用1.8%瓊脂糖凝膠電泳、RT-PCR對DNA作進一步分析。

ChIP的一般流程

甲醛處理細(xì)胞---收集細(xì)胞，超聲破碎---加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復(fù)合物相互結(jié)合---加入ProteinA，結(jié)合抗體-靶蛋白-DNA復(fù)合物，并沉淀---對沉淀下來的復(fù)合物進行清洗，除去一些非特異性結(jié)合---洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復(fù)合物---解交聯(lián)，純化富集的DNA-片斷---PCR分析。

ChIP的步驟

基本的ChIP 實驗包括五個步驟（如下圖），分別是交聯(lián)、染色質(zhì)片段化、免疫沉淀、DNA 回收和純化以及分析 DNA。由于實驗材料的不同，可能會造成在交聯(lián)和染色質(zhì)片段化方面存在一些不同，需要不斷優(yōu)化條件，才能得到高質(zhì)量的 DNA 從而進行后續(xù)的 ChIP 分析。

1、

交聯(lián)固定

一般采用1% formaldehyde（甲醛）室溫交聯(lián)10-30分鐘，交聯(lián)的目的是為了建立蛋白質(zhì)/DNA之間的穩(wěn)定共價連接，這個過程要注意一下幾點。（1）一定要使用新鮮甲醛溶液，因為甲醛容易被氧化，導(dǎo)致交聯(lián)不充分，在后續(xù)染色質(zhì)剪切的時候則容易破壞蛋白和DNA的共價連接。（2）交聯(lián)的時間10-30分鐘，如果研究對象為轉(zhuǎn)錄因子等豐度比較高，和DNA結(jié)合也很穩(wěn)定，交聯(lián)10min即可，如果研究對象為轉(zhuǎn)錄輔因子等豐度比較低，也不是直接與DNA結(jié)合，則適當(dāng)延長交聯(lián)時間至30min。

2、

染色質(zhì)片段化

根據(jù)染色質(zhì)剪切方式的不同，目前市面上提供兩種試劑盒，酶解法和超聲法的試劑盒。

酶解法則是在交聯(lián)處理之后，加入適量的核酸酶特異性的切割核小體，將核小體切割成以1個、2個……核小體為單位的片段。到這里，有些小伙伴可能就摩拳擦掌準(zhǔn)備接下來的免疫沉淀了，但是小優(yōu)提醒您，酶解之后，樣品并沒有*切割好，還需要經(jīng)過短暫的超聲處理，把細(xì)胞膜和核膜充分打碎，使染色質(zhì)片段*釋放出來。

如果是超聲法，則比較簡單了，調(diào)整到合適的超聲功率，將樣品超聲處理適當(dāng)?shù)臅r間就好了。在這個過程中要摸索好超聲的條件，過度超聲有可能破壞染色質(zhì)完整性，會給ChIP實驗富集帶來負(fù)面影響，尤其是轉(zhuǎn)錄因子和輔因子。

3、

免疫沉淀

向樣品中加入抗體將目的蛋白和連接的DNA拉下來。這個過程中引入protein G微珠，將目的蛋白和與它結(jié)合的DNA拉下來，這個過程中或多或少也會把其他雜蛋白一起拉下來，所以接下來進行高鹽和低鹽的洗脫，去掉雜質(zhì)。

在這個過程中選擇合適的抗體對實驗結(jié)果至關(guān)重要。如果您需要做測序，則要選擇ChIP-seq級的抗體，如果只是做PCR，選擇ChIP級抗體即可。因為ChIP級抗體除了要結(jié)合*裸露的靶蛋白之外，還要結(jié)合因構(gòu)象變化被DNA遮蔽的抗原表位，而ChIP-seq則需要檢測全基因組上大量的成千上萬的基因位點。所以要嚴(yán)格選擇相應(yīng)級別的抗體。

4、

DNA 回收和純化

用蛋白酶K解交聯(lián)，消化染色質(zhì)的蛋白質(zhì)組分和DNA之間的連接，然后經(jīng)過DNA純化柱對樣品進行純化。

5、

分析 DNA

純化好的DNA進行PCR或者測序分析。

ChIP的應(yīng)用

轉(zhuǎn)錄因子

利用 ChIP 檢測特定的轉(zhuǎn)錄因子在基因組中的結(jié)合位置及序列，可發(fā)現(xiàn)下游基因的順式調(diào)控元件，從而幫助完善轉(zhuǎn)錄因子參與的分子通路。

轉(zhuǎn)錄機制

ChIP 可用于檢測 RNA 聚合酶II以及其他轉(zhuǎn)錄組分的結(jié)合位點，從而發(fā)現(xiàn)啟動子和增強子的序列，同時也可能發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。

組蛋白特異性修飾位點

ChIP 研究在組蛋白密碼的發(fā)現(xiàn)和表征方面起著關(guān)鍵的作用，通過 ChIP 可發(fā)現(xiàn)組蛋白特異性修飾的水平，同時也可明確組蛋白的修飾對基因的調(diào)控作用。

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