流式分析樣品的準(zhǔn)備

流式分析樣品的準(zhǔn)備

流式一、

樣品的準(zhǔn)備

試驗(yàn)一：組織培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞準(zhǔn)備

材料

AccutaseTM Enzyme Cell *培養(yǎng)基（eBioscience Cat.No. 00-4555）　　流式細(xì)胞儀染色液（eBioscience Cat.No. 00-4222）　　15或50ml尖底離心管

實(shí)驗(yàn)過程

1． 對于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，把細(xì)胞分裝到一個(gè)尖底離心管中，對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和活性分析，然后進(jìn)入步驟3；

2． 對于貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，建議用AccutaseTM Enzyme Cell *培養(yǎng)基從培養(yǎng)皿上吹起并吹散細(xì)胞凝聚物，然后把細(xì)胞分裝到一個(gè)尖底離心管中，對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和活性分析，進(jìn)入步驟3；

3． 離心細(xì)胞然后用流式細(xì)胞儀染色液重懸細(xì)胞使其終濃度為2×107個(gè)細(xì)胞/ml。

試驗(yàn)二：淋巴組織的細(xì)胞準(zhǔn)備

材料

60×15 mm 組織培養(yǎng)皿

3 ml注射器

細(xì)胞濾網(wǎng)（血液尼龍濾網(wǎng)）

流式細(xì)胞儀染色液（eBioscience Cat.No. 00-4222）

15或50ml尖底離心管

實(shí)驗(yàn)過程

1． 采集組織（采集組織（脾，淋巴結(jié)，胸腺）放進(jìn)一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用3 ml注射器的活塞擠壓以制成單細(xì)胞懸液，此過程用10ml的染色緩沖液；

2． 加入10ml染色液收集細(xì)胞，使細(xì)胞懸液通過尼龍濾網(wǎng)以除去成團(tuán)的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，收集細(xì)胞懸液于尖底離心管中；

3． 4℃離心細(xì)胞懸液4-5分鐘（300-400g），棄掉上清液；

4． 重懸細(xì)胞沉淀，細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性分析；

5． 按照步驟3離心細(xì)胞然后用合適體積的染色液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞終濃度為2×107個(gè)細(xì)胞/ml。

試驗(yàn)三：非淋巴組織的細(xì)胞制備

材料

剪刀或者手術(shù)刀片

PBS

60×15 mm 組織培養(yǎng)皿

3 ml注射器

細(xì)胞濾網(wǎng)（血液尼龍濾網(wǎng)）

流式細(xì)胞儀染色液（eBioscience Cat.No. 00-4222）

15或50ml尖底離心管

實(shí)驗(yàn)過程

1． 采集組織，用剪刀或手術(shù)刀切成2-4mm的小塊；

2． 按照酶的使用說明書，加入適量用PBS稀釋的酶，孵育。酶的選擇可以參照以下：http://www.tissuedissociation。。ｃｏｍ；

3． 用移液管輕輕吹散細(xì)胞，并用濾網(wǎng)過濾除去成團(tuán)的細(xì)胞和細(xì)胞碎片；

4． 4℃離心細(xì)胞懸液4-5分鐘（300-400g），棄掉上清液；

5． 用PBS重懸細(xì)胞沉淀以移除剩余的酶溶液；

6． 重復(fù)步驟4；

7． 重復(fù)步驟5和6；

8． 用流式染色液重懸細(xì)胞沉淀，細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性分析；

9． 按照步驟4離心細(xì)胞然后用合適體積的染色液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞終濃度為2×107個(gè)細(xì)胞/ml。

試驗(yàn)四：

材料

PBS

FicollTM或其它的培養(yǎng)基

流式細(xì)胞儀染色液（eBioscience Cat.No. 00-4222）

15或50ml尖底離心管實(shí)驗(yàn)過程

1． 在尖底離心管中用PBS按1:1的比例稀釋血樣；

2． 用FicollTM 等倍稀釋樣品；

3． 離心20分鐘；

4． 收集PBS和FicollTM交界處的PBMC；

5． 在試管中加入PBS；

6． 4℃離心細(xì)胞懸液4-5分鐘（300-400g），棄掉上清液；

7． 用流式染色液重懸細(xì)胞沉淀，細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性分析；

8． 按照步驟6離心細(xì)胞然后用合適體積的染色液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞終濃度為2×107個(gè)細(xì)胞/ml。

用淋巴組織細(xì)胞懸液在流式細(xì)胞儀上分析以前，去掉紅細(xì)胞。

試驗(yàn)一：鼠脾細(xì)胞中紅細(xì)胞的裂解：

材料

1×PBS

eBioscience 紅細(xì)胞裂解液(Cat.No.00-4333)

50ml 尖底管

1． 采集小鼠的脾臟并且制成單細(xì)胞懸液；

2． 4℃ 離心沉淀細(xì)胞（300-400g），棄掉上清液；

3． 用5ml脾的紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞；

4． 室溫震蕩孵育4-5分鐘（也可在冰上進(jìn)行）；

5． 加入20-30ml PBS 停止反應(yīng)；

6． 4℃ 離心沉淀細(xì)胞（300-400g），然后用合適體積的緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，繼續(xù)下一步試驗(yàn)；

7． 細(xì)胞計(jì)數(shù)。

試驗(yàn)二：小鼠血液的紅細(xì)胞裂解

材料

1×PBS

eBioscience 紅細(xì)胞裂解液(Cat.No.00-4333)

50ml 尖底管

1． 1ml小鼠血液中加入10ml 紅細(xì)胞裂解液；

2． 室溫震蕩孵育4-5分鐘（也可在冰上進(jìn)行）；

3． 加入20-30ml PBS 停止反應(yīng)；

4． 4℃ 離心沉淀細(xì)胞（300-400g），然后用合適體積的緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，繼續(xù)下一步試驗(yàn)；

5． 細(xì)胞計(jì)數(shù)。

試驗(yàn)三：人外周血中紅細(xì)胞的裂解

材料

1×PBS

eBioscience 紅細(xì)胞裂解液(Cat.No.00-4333)

50ml 尖底管

1． 1ml人的血液中加入10ml 紅細(xì)胞裂解液；

2． 室溫孵育10分鐘（不要超過15分鐘）；

3． 加入20-30ml PBS 停止反應(yīng)；

4． 4℃ 離心沉淀細(xì)胞（300-400g），

然后用合適體積的緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，繼續(xù)下一步試驗(yàn)；

5． 細(xì)胞計(jì)數(shù)。