睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（CNTF）檢測試劑盒說明書

睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)檢測試劑盒

檢測范圍 46.88-3000pg/mL 靈敏度 16.49pg/mL
樣本類型 Serum, plasma and other biological fluids.
實驗時長 4.5h 實驗方法 雙抗夾心法

睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)
適用生物：人
使用說明書
僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!
[預(yù)期應(yīng)用]
本試劑盒運用雙抗體夾心ELISA 法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中CNTF 含量。
[試劑盒內(nèi)容]
試劑名稱數(shù)量試劑名稱數(shù)量
96孔板(預(yù)包被) 1 96孔板覆膜4
標(biāo)準(zhǔn)品2 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1×20mL
檢測溶液A 1×120μL 檢測稀釋液A 1×12mL
檢測溶液B 1×120μL 檢測稀釋液B 1×12mL
TMB底物1×9mL 終止液1×6mL
濃洗滌液(30×) 1×20mL 使用說明書1
[需自備的設(shè)備及試劑]
1、450±10nm 濾光片的酶標(biāo)儀(建議儀器使用前提前預(yù)熱)
2、單道或多道微量加液器及吸頭
3、稀釋樣品的EP 管
4、蒸餾水或去離子水
5、吸水紙
6、盛放洗液的容器
[試劑盒的儲存及有效期]
1、未開封的試劑盒：所有試劑均按試劑瓶標(biāo)簽上所示保存。請注意，收到試劑盒后請盡快將標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶
液A、檢測溶液B 以及96 孔板保存于-20oC。
2、使用后的試劑盒：剩余試劑仍需按照試劑瓶標(biāo)簽所示的溫度保存，開封后的酶標(biāo)板要加干燥劑后密封保存于
-20oC，避免潮濕。
注意：
試劑盒內(nèi)酶標(biāo)條可拆卸，按實驗需求可分多次使用；使用后的剩余試劑盒建議在實驗后1 個月內(nèi)使用完畢。
產(chǎn)品過期時間以盒子上的標(biāo)簽為準(zhǔn)，保質(zhì)期內(nèi)所有組分都確保是穩(wěn)定的。
[標(biāo)本的采集與保存]
1、血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2 小時或4oC ，然后1000×g 離心20 分鐘，取上清即
可，或?qū)⑸锨逯糜?20oC 或-80oC 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2、血漿：用EDTA 或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30 分鐘內(nèi)于2-8oC 1000×g 離心15 分鐘，
取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20oC 或-80oC 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3、其它生物標(biāo)本：請1000×g 離心20 分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20oC 或-80oC 保存，但應(yīng)避免反
復(fù)凍融。
注意：
1、以上標(biāo)本均需密封保存，4oC 保存應(yīng)小于1 周，-20oC 不應(yīng)超過1 個月，-80oC 不應(yīng)超過2 個月。
2、標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。
3、標(biāo)本使用前應(yīng)緩慢均衡至室溫，不應(yīng)加熱使之融解。
[試劑準(zhǔn)備]
1、使用前將所有的試劑和標(biāo)本緩慢均衡至室溫(18-25oC)，試劑不能直接在37oC 溶解。
2、標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品)：每瓶標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液0.5mL，蓋好后室溫靜置大約10 分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動
以助溶解，其濃度為3,000pg/mL。準(zhǔn)備7 個稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的EP 管，每個EP 管中加入250μL 的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，
如圖所示依次倍比稀釋成3,000pg/mL，1,500pg/mL，750pg/mL，375pg/mL，187.5pg/mL，93.75pg/mL，
46.88pg/mL，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(0pg/mL)直接作為空白孔。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品
溶液。
Tube 1 2 3 4 5 6 7 8
pg/mL 3,000 1,500 750 375 187.5 93.75 46.88 0
3、檢測溶液A 及檢測溶液B：Detection A 及Detection B 在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或
瓶蓋的液體沉積到管底。臨用前分別以檢測稀釋液A 或B1:100 稀釋(如：10μL 檢測溶液A/990μL 檢測稀釋
液A)，充分混勻，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制(100μL/孔)，實際配制時應(yīng)多配制
0.1-0.2mL。
4、濃洗滌液：用580mL 蒸餾水或去離子水將20mL 濃洗滌液稀釋至600mL，進行30 倍稀釋。
5、底物溶液：請用滅菌的移液器吸頭吸取所需體積的TMB 至另一干凈容器中使用，容器中剩余的底物應(yīng)予丟棄，
不要倒回TMB 瓶中。
注意：
1、標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋不能直接在板中進行。
2、標(biāo)準(zhǔn)品請于臨用前15 分鐘內(nèi)配制。該標(biāo)準(zhǔn)品只能使用一次。
3、標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A 工作液、檢測溶液B 工作液請使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。混勻時要輕輕充分混
勻，避免起泡。為保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確請使用微量吸管，并校準(zhǔn)微量加液器。請依據(jù)所需的量配制，盡
量不要微量配制(如吸取檢測溶液A 時，一次不要小于10μL)，以避免造成濃度誤差。
4、請勿重復(fù)使用已經(jīng)稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A 工作液和檢測溶液B 工作液。
5、濃洗滌液中如有結(jié)晶析出，請先溫育至室溫，輕輕混勻，至到結(jié)晶*溶解再進行配制。
6、試劑盒中部分試劑為儲存液，客戶需配置成工作液后使用，在配置過程中如因純凈水質(zhì)量差或水質(zhì)污染，以
及實驗中所用耗材潔凈度差，可能造成實驗結(jié)果不準(zhǔn)確，甚至*錯誤，請使用雙蒸水。
[標(biāo)本處理]
1、Cloud-Clone 公司只對試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé)，請使用者使用前充分
考慮到樣本的可能使用量，預(yù)留充足的樣本。
2、實驗前應(yīng)預(yù)測標(biāo)本含量，如果標(biāo)本濃度過高，應(yīng)對標(biāo)本進行稀釋，使稀釋后的標(biāo)本符合試劑盒的檢測范圍，
計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。標(biāo)本使用0.01mol/L 的PBS 稀釋(PH=7.0-7.2)。
3、若所檢樣本不包含在說明書所列樣本之中，建議進行預(yù)實驗驗證其有效性，并注意留存樣本。
4、使用化學(xué)裂解液制備的組織勻漿或細(xì)胞提取液可能會由于某些化學(xué)物質(zhì)的引入導(dǎo)致ELISA 實驗結(jié)果偏差。
5、若樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清，因該類樣本干擾因素較多，如：細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞數(shù)量、采樣時間等，所以可能存
在檢測不出的情況。
6、某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因為與本產(chǎn)品所使用的檢測抗體及捕獲抗體不匹
配，而不被檢測出。
7、建議使用新鮮樣本，保存時間過長可能會存在蛋白降解或變性導(dǎo)致實驗結(jié)果偏差。
[操作步驟]
1、加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔、空白孔。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔7 孔，依次加入100μL 不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(見試劑準(zhǔn)
備2)?？瞻卓准?00μL(見試劑準(zhǔn)備第二步zui后一管)，余孔加待測樣品100μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37oC 溫
育2 小時。
2、棄去液體，甩干，不用洗滌。
3、每孔加檢測溶液A 工作液100μL(臨用前配制)，酶標(biāo)板加上覆膜，37oC 溫育1 小時。
4、棄去孔內(nèi)液體，每孔用350μL 的洗滌液洗滌，浸泡1-2 分鐘，吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，
在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)，重復(fù)洗板3 次。zui后一次
洗滌后，要把孔內(nèi)的洗滌液*甩干。自動洗板機亦可。
5、每孔加檢測溶液B 工作液(臨用前配制)100μL，加上覆膜，37oC 溫育30 分鐘。
6、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次，方法同步驟4。
7、每孔加底物溶液90μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37oC 避光顯色(反應(yīng)時間控制在15-25 分鐘，不要超過30 分鐘。
當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4 孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4 孔梯度不明顯時，即可終止)。
8、每孔加終止溶液50μL，終止反應(yīng)，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相
同。如出現(xiàn)顏色不勻一，請輕輕晃動酶標(biāo)板以使溶液混合均勻。
9、在確保酶標(biāo)板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標(biāo)儀在450nm 波長測量各孔的光密度(O.D.值)。
注意：
1、試劑準(zhǔn)備：準(zhǔn)備一次實驗所需要的酶標(biāo)條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說明書要求保存，以備下
次使用。
2、加樣：實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。加樣時注意不要有氣泡，將樣品加于酶標(biāo)板底部，
盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，
將會導(dǎo)致不同的“預(yù)溫育"時間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。因此，一次加樣時間(包括
標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品)控制在10 分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進行實驗。
3、溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時請將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)，洗板后應(yīng)盡快進
行下步操作，任何時侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)，同時應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時間和溫度。
4、洗滌：充分的洗滌非常重要，在每次洗滌過程中，都要將洗滌液*甩干。洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌
液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后
的酶標(biāo)儀讀數(shù)。如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
5、反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如，每隔10 分鐘觀察一次)，如顏色較深，
請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。
6、底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
7、如果實驗室內(nèi)濕度低于60%，推薦使用加濕器提高濕度水平。
[實驗原理]
將CNTF 抗體包被于96 孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本，其中的CNTF 與連接于固
相載體上的抗體結(jié)合，然后加入生物素化的CNTF 抗體，將未結(jié)合的生物素化抗體洗凈后，加入HRP 標(biāo)記的親和
素，再次*洗滌后加入TMB 底物顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的
黃色。顏色的深淺和樣品中的CNTF 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度(O.D.值)，計算樣品濃度。
[計算]
各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本O.D.值扣除空白孔O.D.值后作圖(七點圖)，如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值計算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度
為縱坐標(biāo)(或?qū)?shù)坐標(biāo))，O.D.值為橫坐標(biāo)(或?qū)?shù)坐標(biāo)），繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(*方程式應(yīng)依回歸方程計算的R2值來定，
以R2 值越趨近于1 為好)。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如curve expert 1.30，根據(jù)樣品O.D.值，由標(biāo)
準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與O.D.值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的
O.D.值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
[典型數(shù)據(jù)]
為了便于計算，盡管濃度為自變量而O.D.值為因變量，我們繪圖時仍采用標(biāo)準(zhǔn)品的O.D.值作為橫坐標(biāo)(X 軸)，標(biāo)準(zhǔn)
品的濃度為縱坐標(biāo)(Y 軸)。同時為了試驗結(jié)果的直觀性，圖中提供的是原始數(shù)據(jù)而非對數(shù)值。推薦使用對數(shù)
值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。由于實驗操作條件的不同（如操作者、移液技術(shù)、洗板技術(shù)和溫度條件等），標(biāo)準(zhǔn)曲線的
O.D.值會有所差異。所提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供參考，實驗者需要根據(jù)自已的實驗建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)檢測試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線
[檢測范圍]
46.88pg/mL-3,000pg/mL
[zui低檢測限]
16.49pg/mL
此值為20 個空白樣品(即標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液)測定的平均值加二倍標(biāo)準(zhǔn)差所對應(yīng)的濃度。
[特異性]
本試劑盒用于檢測CNTF，經(jīng)檢測與其它相似物質(zhì)無明顯交叉反應(yīng)。
由于受到技術(shù)及樣本來源的限制，不可能完成對所有相關(guān)或相似物質(zhì)交叉反應(yīng)檢測，因此本試劑盒有可能與未經(jīng)
檢測的其它物質(zhì)有交叉反應(yīng)。
[回收率]
分別于定值血清及血漿樣本中加入一定量的CNTF（加標(biāo)樣品），重復(fù)測定并計算其均值，回收率為測定值與理論
值的比率。
樣本回收率范圍(%) 平均回收率(%)
血清(n=5) 88-99 94
EDTA 血漿(n=5) 78-94 87
肝素血漿(n=5) 93-105 98
[線性]
在定值血清及血漿樣本內(nèi)加入適量的CNTF，并倍比稀釋成1:2，1:4，1:8，1:16 的待測樣本，線性范圍即為稀釋
后樣本中CNTF 含量的測定值與理論值的比率。
樣本1：2 1：4 1：8 1：16
血清(n=5) 95-105% 84-99% 85-93% 80-92%
EDTA 血漿(n=5) 80-90% 82-96% 79-101% 87-98%
肝素血漿(n=5) 78-95% 87-101% 88-102% 96-105%
[精密度]
精密度用樣品測定值的變異系數(shù)CV 表示。CV(%) = SD/mean×100
批內(nèi)差：取同批次試劑盒對低、中、高值定值樣本進行定量檢測,每份樣本連續(xù)測定20 次，分別計算不同濃度樣
本的平均值及SD 值。
批間差：選取3 個不同批次的試劑盒分別對低、中、高值定值樣本進行定量測定，每個樣本使用同一試劑盒重復(fù)
測定8 次，分別計算不同濃度樣本的平均值及SD 值。
批內(nèi)差： CV<10%
批間差： CV<12%
[穩(wěn)定性]
經(jīng)測定，試劑盒在有效期內(nèi)按推薦溫度保存，其活性降低率小于5%。
為減小外部因素對試劑盒破壞前后檢測值的影響，實驗室的環(huán)境條件需盡量保持一致，尤其是實驗室內(nèi)溫度、濕
度及溫育條件。其次由同一實驗員來進行操作可減少人為誤差。
[實驗流程]
1、實驗前標(biāo)準(zhǔn)品、試劑及樣本的準(zhǔn)備；
2、加樣（標(biāo)準(zhǔn)品及樣本）100μL，37oC孵育2小時；
3、吸棄，加檢測溶液A100μL，37oC孵育1小時；
4、洗板3次；
5、加檢測溶液B100μL，37oC孵育30分鐘；
6、洗板5次；
7、加TMB底物90μL，37oC孵育15－25分鐘；
8、加終止液50μL，立即450nm讀數(shù)。
[說明]
1、由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在
一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險。
2、zui終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當(dāng)時的實驗環(huán)境密切相關(guān)，請務(wù)必準(zhǔn)備充足的標(biāo)本
備份。
3、不同批次的同一產(chǎn)品可能會有少許差別，如：檢測限、靈敏度以及顯色時間等，請依據(jù)試劑盒內(nèi)說明書進行
實驗操作，電子版說明書僅作參考。
4、只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)格遵守本試劑盒的
實驗說明才會得到*的檢測結(jié)果。
5、在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，因為蛋白
水解酶的干擾將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。
6、剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。請勿提前將酶
標(biāo)板從包裝袋里拿出。
7、由于操作者不熟練、操作失誤或讀數(shù)儀程序選用錯誤等有可能會導(dǎo)致錯誤結(jié)果的產(chǎn)生。請使用者使用該產(chǎn)品
前仔細(xì)閱讀說明書，調(diào)試好酶標(biāo)儀，請使用配備有450±10nm 濾光片的酶標(biāo)儀，且該酶標(biāo)儀測量范圍在
0.001-3.000 O.D.或以上。
對ELISA 操作不熟悉的可以參照視頻( http://www.cloud-clone.us/homepage/operate.htm )。
8、同一使用者在使用同一產(chǎn)品時，如不同時間訂購，也可能會因不同批次的少量差異產(chǎn)生不同結(jié)果，因此建議
使用者在每次使用前均進行預(yù)實驗。
9、試劑盒在出廠前均經(jīng)過嚴(yán)格檢測，但由于運輸條件及各實驗室條件差異，可能會造成實驗結(jié)果與出廠結(jié)果不
一致或不同批次試劑盒批間差大的情況，對于這種情況會酌情處理。
10、本試劑盒未與其他廠家同類試劑盒或不同方法檢測同一目的蛋白的產(chǎn)品做對比，平行檢測可能會存在檢測結(jié)
果不一致的情況。
11、本操作說明同樣適用于48T 試劑盒，但48T 試劑盒所有試劑減半。
[警告]
本試劑盒中使用了稀硫酸作為終止液，其具有輕微腐蝕性，使用時應(yīng)避免接觸衣物或眼、手等皮膚暴露部位。
[問題解答]
問題可能原因解決方案
標(biāo)準(zhǔn)曲線差
標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備不正確進行正確的標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋
吸取及洗滌不充分充分的吸取及洗滌
移液不檢查和校正移液器
精密度低
洗滌不充分按說明書要求充分洗滌和浸泡
混勻不充分和吸取試劑不足充分混勻和吸取試劑
重復(fù)利用吸頭、容器和覆膜使用加樣器要更換新的吸頭、使用新的容器和覆膜
加樣不檢查和校正移液器
O.D 值低
每孔加的試劑量不校正移液器，加入試劑
溫育時間不正確保證充足的溫育時間
溫育溫度不正確試劑要平衡至室溫并保證準(zhǔn)確的溫育溫度
酶標(biāo)記物或底物失效通過混合酶標(biāo)記物和底物，顏色應(yīng)迅速顯現(xiàn)來檢查
沒有加入終止液按照說明書實驗操作步驟加入終止液
超出讀數(shù)時間讀數(shù)在說明書推薦的讀數(shù)時間內(nèi)讀數(shù)
樣本值
不正確的樣本儲存方式正確儲存樣本，使用新鮮樣本進行實驗
不正確的樣本收集和處理方法采取正確的樣本收集和處理方法
待測物質(zhì)在樣本中含量低使用新鮮樣本，重復(fù)實驗