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人尿激酶型纖溶酶原激活因子(uPA)試劑盒

本試劑盒采用夾心法酶聯(lián)免疫吸附法，用于體外定量分析人血清、血漿、細(xì)胞裂解液或細(xì)胞培養(yǎng)上清中uPA的含量。預(yù)先包被的抗體和檢測(cè)相抗體都是uPA多克隆抗體。檢測(cè)相抗體經(jīng)生物素標(biāo)記。樣品和生物素標(biāo)記抗體先后加入酶標(biāo)板孔反應(yīng)后，PBS或TBS洗滌。隨后加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素反應(yīng)；經(jīng)過(guò)PBS或TBS的*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人uPA呈正相關(guān)。

Urokinase-Plasminogen Activator是一個(gè)有嚴(yán)格底物限制的絲氨酸酶,切除纖溶酶原中的Cys-Pro-Gly-Arg560-Val1561-Val-Gly-Cys序列，形成纖溶酶。uPA是一系列腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的有力標(biāo)志。人的 uPA初始合成時(shí)有431個(gè)氨基酸（N端20個(gè)氨基酸的引導(dǎo)片段），進(jìn)一步組成二硫鍵連接的A/B二條鏈蛋白質(zhì)。A鏈有兩種長(zhǎng)度：長(zhǎng)A鏈從Ser21開(kāi)始，短A鏈從Lys156開(kāi)始。B鏈從IIe179開(kāi)始。長(zhǎng)A鏈uPA含有EGF樣決定簇，可以結(jié)合至uPAR。上述長(zhǎng)短兩種形式在人重組uPA中都有，分子量分別為32KDa，18KDa。


檢測(cè)指標(biāo)：PLAU；uPA；尿激酶纖溶酶原激活物；尿激酶型纖溶酶原激活劑
檢測(cè)范圍：62.5pg/ml～4000pg/ml
特異性：系統(tǒng)和其它細(xì)胞因子無(wú)交叉反應(yīng)
敏感性：＜2pg/ml

產(chǎn)品組成：

儲(chǔ)存條件：2-8℃（頻繁使用時(shí)），-20℃（長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)）
有效期：6個(gè)月(4℃)；12個(gè)月（-20℃）

參考標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)：(取自某一批次質(zhì)檢數(shù)據(jù)，僅供參考，用戶需要自己建立標(biāo)準(zhǔn)曲線)

人尿激酶型纖溶酶原激活因子(uPA)試劑盒原理:

問(wèn)：同一樣品多次活性測(cè)試結(jié)果差異大怎么解決？

答：樣本保存不當(dāng)，會(huì)導(dǎo)致多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差較大，樣本應(yīng)盡量減少反復(fù)凍融，如需多次檢測(cè)，需在取樣后分裝保存。

問(wèn)：檢測(cè)樣本是細(xì)胞培養(yǎng)上清，那么細(xì)胞數(shù)目對(duì)炎癥因子的濃度有影響嗎？

答：有影響，所以不同樣本可以比較的前提條件是培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)水平接近一致。

問(wèn)：請(qǐng)問(wèn)標(biāo)曲是每次都要做嗎？

答：是的，每次實(shí)驗(yàn)，孵育時(shí)間，洗板次數(shù)等等條件均不一樣，不同實(shí)驗(yàn)的標(biāo)曲不能混用，做一次實(shí)驗(yàn)需要做一次標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且用當(dāng)次，同一塊板上的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果去計(jì)算板內(nèi)樣品的濃度，才能得到準(zhǔn)確的結(jié)果。

問(wèn)：做預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)每種要做幾個(gè)復(fù)孔呀？

答：預(yù)實(shí)驗(yàn)視情況而定，如果整個(gè)板子孔數(shù)較為充足，建議兩個(gè)復(fù)孔，如不充足，單孔也可以。要盡量保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程中加樣準(zhǔn)確。

問(wèn)：血清樣本少量溶血，顏色稍深，對(duì)結(jié)有影響嗎？

答：會(huì)有影響，建議取樣時(shí)需注意，避免溶血、脂血等樣本。如樣本條件受限，建議用樣本稀釋液適當(dāng)稀釋，減少基質(zhì)效應(yīng)影響。

問(wèn)：試劑盒有推薦稀釋濃度還需要自己測(cè)嗎？

答：試劑盒一般會(huì)給出不同樣品的推薦稀釋比例，但是為大致范圍，還是根據(jù)自己的樣本情況，設(shè)計(jì)預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)量計(jì)算。

問(wèn)：加完終止液之后測(cè)的幾次數(shù)據(jù)差別也蠻大？

答：加完終止液后，顯色反應(yīng)也不是永遠(yuǎn)停止，形成的黃色顏色會(huì)隨著時(shí)間延長(zhǎng)繼續(xù)加深，建議在15 min內(nèi)讀數(shù)。

問(wèn)：副孔差別比較大，是沒(méi)洗干凈嗎？

答：復(fù)孔值差異較大，主要原因應(yīng)考慮加樣是否準(zhǔn)確，洗板過(guò)程中是否有殘留以及是否有交叉污染。

問(wèn)：配好的抗體沒(méi)用完如何保存，可保存多久？預(yù)實(shí)驗(yàn)用了一個(gè)試劑盒里面的部分板子和試劑，剩下的板子和試劑還能繼續(xù)用于正式實(shí)驗(yàn)嗎？

答：一般來(lái)講，配好的母液，可以在四度保存，多一個(gè)月左右。剩下的板子和試劑是可以繼續(xù)用于正式實(shí)驗(yàn)的，間隔時(shí)間不要太長(zhǎng)，一個(gè)月之內(nèi)均可，需注意試劑避免污染，板子保持干燥。

問(wèn)：后顯示的OD值在多少之間屬于可用值，有要求嗎？

答：有的，建議標(biāo)準(zhǔn)曲線高濃度點(diǎn)的OD值在2.0左右較好，也可參考說(shuō)明書(shū)標(biāo)曲的數(shù)據(jù)。

問(wèn)：樣本總是在標(biāo)準(zhǔn)曲線之外，稀釋100倍也是，怎么辦？

答：在設(shè)置稀釋倍數(shù)之前，需要參考相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)于一些表達(dá)*的蛋白，確實(shí)會(huì)出現(xiàn)這種情況，建議繼續(xù)提高稀釋比例。

問(wèn)：試劑盒推薦用450和540nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)，但條件有限可否換成450和620的雙波長(zhǎng)？如何使用校準(zhǔn)波長(zhǎng)？還有，用空白孔校準(zhǔn)可以么？

答：可以的，TMB底物顯色后，吸光峰值在450nm，另外的校準(zhǔn)波長(zhǎng)是防止氣泡等雜質(zhì)造成的干擾設(shè)置，避開(kāi)450左右50nm以上即可。兩次讀取的OD值，用OD450 - OD校準(zhǔn)波長(zhǎng)即可。盡量還是建議有條件的選用雙波長(zhǎng)校準(zhǔn)的方法，因?yàn)楸苊饬瞬煌椎淖x數(shù)影響，防止出現(xiàn)空白孔污染，導(dǎo)致讀數(shù)較高，無(wú)法校準(zhǔn)的情況。

問(wèn)：ELISA可以檢測(cè)胞內(nèi)蛋白么？

答：可以的，選用支持組織勻漿的ELISA試劑盒即可，將組織樣品或細(xì)胞樣品進(jìn)行裂解，提取胞內(nèi)蛋白后進(jìn)行蛋白定量，保證每孔上樣總蛋白量一致即可。

問(wèn)：ELISA試劑盒顯色液是雙組份的，有些其他品牌的是單組分的，使用單組分的有影響么？

答：HRP酶標(biāo)二抗的ELISA試劑盒，顯色底物一般為T(mén)MB，TMB不穩(wěn)定，曝光或污染氧化后會(huì)出現(xiàn)顯色反應(yīng)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)背景升高，或無(wú)法使用，所以愛(ài)必信的ELISA試劑盒將顯色液調(diào)整為雙組份，方便穩(wěn)定保存，僅在使用前混合，避免了TMB的不穩(wěn)定影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如您選用的試劑盒為單組分顯色液，在使用前檢測(cè)是否為無(wú)色透明，如果是正常的，對(duì)結(jié)果也沒(méi)有影響，可以放心使用。

問(wèn)：整個(gè)過(guò)程需要避光嗎？避光需要避到什么程度呢？

答：ELISA實(shí)驗(yàn)中，在酶標(biāo)抗體孵育，以及顯色底物孵育這兩步建議避光，其他步驟無(wú)需避光。避光可采用錫紙包裹，或?qū)⒄麄€(gè)ELISA板子放入暗盒或抽屜等無(wú)光處即可。

問(wèn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線在推薦的濃度下，r值為0.9，做了多次都是這樣，怎么辦？

答：要仔細(xì)核對(duì)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，看是否用了推薦的擬合方法，如愛(ài)必信的ELISA試劑盒，需要使用四參數(shù)擬合方式進(jìn)行擬合，用錯(cuò)擬合方式，會(huì)導(dǎo)致r方值較低；如擬合方式無(wú)誤，需檢查是否有個(gè)別標(biāo)曲孔數(shù)值異常，排查實(shí)驗(yàn)中是否出現(xiàn)污染或倍比稀釋時(shí)出現(xiàn)失誤。

問(wèn)：封板膜什么時(shí)候用？每次加液后都要換嗎？

答：封板膜在孵育樣品、檢測(cè)抗體以及HRP酶標(biāo)抗體是，都要蓋好封板膜，減少揮發(fā)及污染幾率。每次使用后要更換新的封板膜。

問(wèn)：手動(dòng)洗板過(guò)程中，拍過(guò)抗體或抗原的濾紙需要扔嗎？

答：是需要更換的，防止造成交叉污染，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

問(wèn)：有的wash buffer析出結(jié)晶后在37℃也不溶解，怎么辦？

答：可提高至55度，并多次搖晃。溶解后按比例稀釋即可使用。

問(wèn)：測(cè)得的值都低于標(biāo)準(zhǔn)曲線的低值，是什么原因，應(yīng)該怎么解決？

答：原因較多，首先是檢查樣品是否稀釋倍數(shù)過(guò)高，降低稀釋比，直至直接加樣本原液，如還檢測(cè)不出，需排查原因，建議在實(shí)驗(yàn)組別設(shè)置中添加陽(yáng)性對(duì)照孔，用明確表達(dá)的樣品作為陽(yáng)性對(duì)照，如果標(biāo)準(zhǔn)曲線及陽(yáng)性樣品均可測(cè)得正常的表達(dá)濃度，則表明實(shí)驗(yàn)成功，其余待測(cè)樣品表達(dá)含量低于檢測(cè)下限，按照0計(jì)算即可。這種情況尤其對(duì)于炎癥因子較為常見(jiàn)，在健康樣本中，表達(dá)含量極低。

問(wèn)：因?yàn)闄z測(cè)限的原因，同一塊ELISA板子，部分樣本稀釋，部分樣本1:10稀釋，部分1:20稀釋，這樣設(shè)置可行嗎？結(jié)果可以比較嗎？

答：可以比較，不同稀釋比例，是因?yàn)椴煌瑯颖鹃g的表達(dá)差異較大，只要保證稀釋后的檢測(cè)樣品測(cè)量值準(zhǔn)確，還原回稀釋倍數(shù)后的濃度是可信的?？梢杂脕?lái)比較不同樣本的原始濃度差。

問(wèn)：試劑盒里面有捕獲抗體么？

答：即用型ELISA試劑盒中，捕獲抗體已經(jīng)預(yù)包被至試劑盒中的ELISA板上，沒(méi)有單獨(dú)的捕獲抗體提供，直接使用ELISA板孵育稀釋后的樣本及標(biāo)準(zhǔn)品即可。

問(wèn)：ELISA實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)計(jì)算抗原的濃度，臨界值怎么確定？

答：根據(jù)曲線測(cè)定的濃度，建議落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間位置較好，極限不要超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線的上下限，如果超出較多，會(huì)影響計(jì)算結(jié)果準(zhǔn)確性，建議調(diào)整稀釋比例。

問(wèn)：In vivo周期長(zhǎng)的話，不太好做預(yù)實(shí)驗(yàn)，怎么辦？

答：In vivo造模取樣后，可將樣品分裝，取一部分樣品做ELISA預(yù)實(shí)驗(yàn)，剩余樣品再進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)；如多批次實(shí)驗(yàn)，操作較為一致，后續(xù)可取消預(yù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)前期結(jié)果進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置。

問(wèn)：做實(shí)驗(yàn)前怎么知道待測(cè)血清中炎癥因子的范圍呢？多大是高多小是低？

答：需要根據(jù)文獻(xiàn)推測(cè)，一般在健康人樣本中，炎癥因子表達(dá)很低，接近ELISA檢測(cè)下限，樣品無(wú)需稀釋或1:1稀釋即可，如已知為炎癥疾病或造模樣本，可參考文獻(xiàn)，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中設(shè)置1:10-100（或更高）的稀釋比例，預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)后確定佳濃度進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

問(wèn)：ELISA實(shí)驗(yàn)中的洗板步驟如果沒(méi)有洗板機(jī)，需要如何操作？

答：實(shí)驗(yàn)室ELISA實(shí)驗(yàn)做的較多，還是建議使用洗板機(jī)洗板，效果更好，也更方便控制。如果沒(méi)有洗板機(jī)，在洗板過(guò)程中，需要注意洗板液添加后不要從孔中溢出，在加洗板液后，靜置1-2min，甩干液體后，在吸水紙上大力拍干；重復(fù)三次。

問(wèn)：ELISA實(shí)驗(yàn)中，酶標(biāo)抗體識(shí)別的是哪個(gè)抗體？

答：在雙抗夾心法ELISA中，酶標(biāo)抗體識(shí)別的是檢測(cè)抗體，對(duì)檢測(cè)抗體進(jìn)行識(shí)別和酶標(biāo)記。

問(wèn)：捕獲抗體如何包被在96孔板上？

答：如果選用的是即用型ELISA試劑盒，無(wú)需進(jìn)行抗體包被；如果是非即用型的ELISA試劑盒，首先，要選擇ELIS*別的板子，材質(zhì)應(yīng)為聚苯乙烯；然后用抗體包被液稀釋（pH9.6的碳酸鹽緩沖液或pH7.2的PBS或pH7-8的Tris-HCl）成工作濃度，然后每孔加100 μl稀釋后的捕獲抗體，室溫或4℃過(guò)夜包被，然后進(jìn)行洗板和封閉之后即可使用，如需長(zhǎng)期保存，需要真空凍干后保存

問(wèn)：ELISA實(shí)驗(yàn)中的捕獲抗體和檢測(cè)抗體是同一個(gè)抗體么？

答：不是的，在雙抗夾心法ELISA實(shí)驗(yàn)中，會(huì)同時(shí)用到捕獲抗體和檢測(cè)抗體，這兩個(gè)抗體是針對(duì)同一抗原蛋白的不同抗原位點(diǎn)的兩種抗體，這樣才可以同時(shí)結(jié)合抗原分子。

問(wèn)： ELISA可以測(cè)DNA的表觀么？

答：不可以，ELISA是利用免疫學(xué)原理，定量檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)的技術(shù)。測(cè)DNA表觀遺傳學(xué)，主要是檢測(cè)DNA甲基化，可以選用ChIP技術(shù)。