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EHA101 Chemically Competent Cell

產(chǎn)品規(guī)格 

EHA101：                                                                  100μl/支
pK7WGF2（control vector，10ng/μl )                            10μl
保存條件(保質(zhì)期)：                                         -80℃（12個月） 

 基因型

C58 (rif^R) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kan^R) Nopaline

EHA101 Chemically Competent Cell產(chǎn)品說明

EHA101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此質(zhì)粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移)。pEHA101 (pTiBo542DT-DNA) 型Ti質(zhì)粒含有篩選標簽：kan，賦予EHA101菌株和卡那霉素抗性，適用于玉米、水稻、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作。本公司生產(chǎn)的EHA101化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作，pK7WGF2質(zhì)粒（壯觀霉素抗性）檢測轉(zhuǎn)化效率>10⁴ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)于室溫或手心片刻待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時插入冰中。

2.每100 μl感受態(tài)加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA（轉(zhuǎn)化效率較高，一次使用前做預(yù)實驗確定所加質(zhì)粒的量），用手打管底混勻，依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、37℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。

3. 加入700 μl無抗生素的LB或YEB液體培養(yǎng)基，于28℃，200 rpm振蕩培養(yǎng)2~3小時。

4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天。

（當(dāng)平板只含有轉(zhuǎn)化所用雙元載體抗生素時，28℃培養(yǎng)48小時即可；平板中同時加入雙元載體抗生素，20 μg/ml rif 時，需28℃培養(yǎng)60小時；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90小時）。

備注

1、農(nóng)桿菌相關(guān)抗生素配方：

2、常用農(nóng)桿菌抗性：（R：抗；S：敏感。）

3、LB及YEB配方：

注意事項

1. 加入質(zhì)粒時體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級。

2. 混入質(zhì)粒時應(yīng)輕柔操作，轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少終用于涂板的菌量。

3. 平板上陽性克隆密度過大時，由于營養(yǎng)不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應(yīng)減少質(zhì)粒用量。

4. 利福平濃度不應(yīng)高于25 μg/ml，過高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長，會降低其生長速度和轉(zhuǎn)化效率。本公司EHA101感受態(tài)計算轉(zhuǎn)化效率時所用平板只含有50 μg/ml 壯觀霉素，若所用平板同時含有20 μg/ml rif則轉(zhuǎn)化效率降低到1/2。

5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入Ti質(zhì)粒篩選抗生素可防止Ti質(zhì)粒丟失，但Ti質(zhì)粒篩選抗生素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時不考慮這些抗生素，Ti質(zhì)粒丟失的概率極低 (可以忽略)。