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Y2HGold Chemically Competent Cell

產(chǎn)品規(guī)格 

Y2HGold Competent Cell:                                  100μl/支              保存：  -80℃（3個(gè)月）

pGADT7 (control vector, 10 ng/μl)                           10μl              保存：-80℃（12個(gè)月）

Carrier DNA (10 μg/μl)                                             100μl              保存：-20℃（12個(gè)月）

PEG/LiAC:                                                                    5ml              保存：    4℃（12個(gè)月）

基因型

MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ, LYS2::GAL1_UAS-Gal1_TATA-His3, GAL2_UAS-Gal2_TATA-Ade2 URA3::MEL1_UAS-Mel1_TATA AUR1-C MEL1

Y2HGold Chemically Competent Cell產(chǎn)品說(shuō)明

Y2HGold菌株是Clontech公司開發(fā)的GAL4系統(tǒng)酵母雙雜實(shí)驗(yàn)用菌株，MATa型，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)?；蚺cMATα型酵母菌株Y187通過(guò)mating操作進(jìn)行蛋白互作驗(yàn)證或篩庫(kù)試驗(yàn)。Transformation marker為：trp1，leu2，報(bào)告基因?yàn)椋?em>AbAr，HIS3，ADE2，MEL1。Y2HGold-GAL4 酵母雙雜系統(tǒng)需要兩種質(zhì)粒配套使用：pGBKT7和pGADT7。質(zhì)粒pGBKT7的篩選標(biāo)志為TRP1，用于表達(dá)DNA-BD (來(lái)自酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4N端1~174位氨基酸)與目標(biāo)蛋白 (Bait)的融合蛋白；質(zhì)粒pGADT7 的篩選標(biāo)志為L(zhǎng)EU，用于表達(dá)AD(GAL4 C端768 ~881 位氨基酸)與目標(biāo)蛋白 (Prey)的融合蛋白。GAL4 系統(tǒng)原理：一個(gè)完整的酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4可分為功能上相互獨(dú)立的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：位于N端1~174位氨基酸區(qū)段的DNA結(jié)合域 (DNA-BD)和位于C端768~881 位氨基酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域 (AD)。DNA-BD能夠識(shí)別GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并與之結(jié)合。而AD可以啟動(dòng)UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。BD和AD單獨(dú)存在不能激活轉(zhuǎn)錄，但當(dāng)二者接近時(shí)，則呈現(xiàn)完整的GAL4活性，使含有UAS的啟動(dòng)子下游基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。正常條件下，BD不與AD結(jié)合，將要檢測(cè)的蛋白質(zhì)分別與BD和AD融合，形成 bait融合蛋白 (bait -BD)和 prey融合蛋白 (prey-AD)，如果 bait和 prey發(fā)生相互作用，就會(huì)促使 BD和 AD的相互接近，形成完整的GAL4，從而激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。Y2HGold有四個(gè)報(bào)告基因：AbAr，HIS3，ADE2，MEL1，分別由三種不同的啟動(dòng)子 (G1，G2，M1)啟動(dòng)，這三種啟動(dòng)子只有GAL4識(shí)別的17 bp核心區(qū)相同，其余部分均不同，大大降低了酵母雙雜假陽(yáng)性發(fā)生的概率。此外新報(bào)告基因AbAr與以前的營(yíng)養(yǎng)缺陷報(bào)告基因相比具有更低背景的優(yōu)點(diǎn)，也可以降低酵母雙雜假陽(yáng)性發(fā)生的概率。Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，-80℃可保存三個(gè)月，pGADT7質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>10⁴cfu/μg DNA。

操作方法

1. 取100 µl冰上融化的Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞，依次加入預(yù)冷的目的質(zhì)粒2-5 µg，Carrier DNA (95-100度5 min,快速冰浴，重復(fù)一次) 10 µl，PEG/LiAc 500µl并吸打幾次混勻，30度水浴30 min (15 min時(shí)翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。

2. 將管放42℃水浴15 min (7.5 min時(shí)翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。

3. 5000 rpm離心 40 s棄上清，ddH₂O 400 µl 重懸，離心 30s棄上清。

4. ddH₂O 50 µl重懸，涂板，29℃培養(yǎng)48-96 h。

注意事項(xiàng)

1. 感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化。

2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少終用于涂板的菌量。

3. 同時(shí)轉(zhuǎn)化2-3種質(zhì)粒時(shí)可增加質(zhì)粒的用量。

4. Y2HGold酵母菌株對(duì)高溫敏感，適生長(zhǎng)溫度為27-30℃；高于31℃，生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。

5. 菌落變粉不是污染，是酵母細(xì)胞生長(zhǎng)中一個(gè)常見現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞在平板培養(yǎng)幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過(guò)自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產(chǎn)物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在細(xì)胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。

6. 酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度比YPDA培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長(zhǎng)越慢，以轉(zhuǎn)化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克??；涂SD單缺平板29℃，48-60 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆。