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NMY51 Chemically Competent Cell

產(chǎn)品規(guī)格

NMY51 Competent Cell:                                     100μl/支              保存： -80℃（3個(gè)月）

pGADT7 (control vector, 10 ng/μl)                           10μl              保存：-80℃（12個(gè)月）

Carrier DNA (10 μg/μl)                                             100μl              保存：-20℃（12個(gè)月）

PEG/LiAC:                                                                    5ml              保存：    4℃（12個(gè)月）

基因型
MATa, his3Δ200, trp1-901, leu2-3, 112, ade2, LYS2::(lexAop)4-HIS3, ura3::(lexAop)₈-lacZ, ade2::(lexAop) ₈-ADE2, GAL4
 

NMY51 Chemically Competent Cell產(chǎn)品說明

DUAL membrane系統(tǒng)是DUAL systems BioTech公司開發(fā)的專門篩選跨膜蛋白間相互作用的檢測(cè)技術(shù)，它利用分離的泛素系統(tǒng) (split-ubiquitin)直接檢測(cè)天然狀態(tài)下膜蛋白間的相互作用，是目前市面上檢測(cè)膜蛋白間相互作用的酵母雙雜系統(tǒng)。此系統(tǒng)采用NMY51酵母菌株，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進(jìn)行蛋白互作驗(yàn)證或篩庫試驗(yàn)；此菌株Transformation marker為：trp1，leu2-3，報(bào)告基因?yàn)椋?em>HIS3，ADE2和 lacZ，步通過營養(yǎng)缺陷型報(bào)告基因 (HIS3，ADE2)進(jìn)行選擇性生長篩選，進(jìn)一步通過 LacZ報(bào)告基因進(jìn)行β-半乳糖分析顯色的定量或半定量篩選，三個(gè)獨(dú)立的報(bào)告基因，受不同啟動(dòng)子的調(diào)控，降低假陽性幾率。原理：泛素 (ubiquitin)分子量很小，由 76 aa殘基組成；泛素作為降解信號(hào)分子，可以連接另外一種蛋白質(zhì)的 N端，然后被泛素專一性蛋白酶 (UBPs)識(shí)別，從而導(dǎo)致與泛素相連的蛋白被酶解。泛素可以人為分成兩部分：N端 (Nub)，C端 (Cub)。首先，人為地將泛素 Nub的 3位異亮氨酸突變?yōu)楦拾彼?(NubI 突變?yōu)?NubG)。這樣與 Cub的親合力大大降低，避免了 Cub和 Nub自我結(jié)合或接近的可能性。其次，將Cub部分與人工合成的 LexA-VP16轉(zhuǎn)錄激活因子融合成一個(gè)融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常條件下 NubG不與Cub 結(jié)合，UBPs也不能識(shí)別分離的泛素，轉(zhuǎn)錄激活因子也不會(huì)被切下來。后，將要檢測(cè)的蛋白質(zhì)分別與NubG和Cub融合，形成 bait融合蛋 (bait-cub-LexA-VP16)和 prey融合蛋白 (prey-NubG)。如果 bait和 prey發(fā)生相互作用，就會(huì)促使 NubG和 Cub的相互接近，被 UBPs識(shí)別，導(dǎo)致 LexA-VP16的解離，進(jìn)入核內(nèi)，從而激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。 此系統(tǒng)可使用四種Bait質(zhì)粒：pBT3-N，pBT3-SUC，pBT3-STE，pBT3-C，篩選標(biāo)志均為LEU；三種Prey質(zhì)粒：pPR3-C ，pPR3-SUC，pPR3-STE，篩選標(biāo)志均為TRP。NMY51感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，-80℃可保存三個(gè)月，pGADT7質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>10⁴cfu/μg DNA。

操作方法

1. 取100 µl冰上融化的NMY51感受態(tài)細(xì)胞，依次加入預(yù)冷的目的質(zhì)粒2-5 µg，Carrier DNA (95-100度5min,快速冰浴，重復(fù)一次）10 µl，PEG/LiAc 500µl并吸打幾次混勻，30度水浴30 min (15 min時(shí)翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。

2. 將管放42℃水浴15 min (7.5 min時(shí)翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。

3. 5000 rpm離心 40s棄上清，ddH₂O 400 µl 重懸，離心 30s棄上清。

4. ddH₂O 50 µl重懸，涂板，29℃培養(yǎng)48-96 h。

注意事項(xiàng)

1. 感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化。

2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少終用于涂板的菌量。

3. 同時(shí)轉(zhuǎn)化2-3種質(zhì)粒時(shí)可增加質(zhì)粒的用量。

4. NMY51酵母菌株對(duì)高溫敏感，適生長溫度為27-30℃；高于31℃，生長速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。

5. 菌落變粉不是污染，是酵母細(xì)胞生長中一個(gè)常見現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞在平板培養(yǎng)幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產(chǎn)物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在細(xì)胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。

6. 酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長速度比YPDA培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長越慢，以轉(zhuǎn)化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克??；涂SD單缺平板29℃，48-60 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆。