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ClearColi K12 Electroporation-Competent Cell

產(chǎn)品規(guī)格

ClearColi K12 Electro  Cell                                       50μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                               10μl

恢復培養(yǎng)基                                                               50ml/瓶

保存條件(保質期)：                                        -80℃（6個月）

基因型

F^–λ^–?endA^–?recA^–frr181 msbA52 ?gutQ ?kdsD ?lpxL ?lpxM ?pagP ?lpxP ?eptA

ClearColi K12 Electroporation-Competent Cell產(chǎn)品說明

ClearColi K12電擊感受態(tài)細胞只能用于電擊轉化，不能用于熱激轉化。ClearColi K12菌株來源于K12 endA- recA-菌株。在K12 endA- recA-菌株中引入突變，導致ClearColi K12細胞壁外層的脂多糖（LPS）被修飾:LPS的低聚糖鏈被刪除，同時LPS的兩個?；溡脖粍h除，進而破壞了ClearColi K12大腸桿菌的內毒素信號通路，使得從該細胞中提取的蛋白或質粒DNA中的內毒素含量極低，提取的無內毒素質粒廣泛應用于后續(xù)的哺乳動物細胞轉化。ClearColi K12同時缺失核酸內切酶 (endA)和重組酶 (recA)，提高了質粒DNA的產(chǎn)量和質量。開發(fā)的ClearColi K12電擊感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質粒檢測轉化效率可達1×10⁷ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的ClearColi K12電擊感受態(tài)細胞插入冰中5 分鐘，待其融化，加入目的DNA ，并用手打EP管底輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，立即插入冰中。

    A. 測定轉化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質粒 pUC19；

    B. 對于未知來源或組分不明的質粒DNA，請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM              EDTA)重懸，DNA濃度不超過100 ng/μl，體積不超過5 μl/50 μl感受態(tài)。

3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態(tài)-DNA混合物快速移到電擊杯中，避免產(chǎn)生氣泡，蓋上杯蓋。

4. 啟動電轉儀，設置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此為BioRad 電轉儀推薦參數(shù)，也可按所用電轉儀推薦的參數(shù)操作），將電擊杯快速放入電轉槽中，電擊完成快速插入冰中。

5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯，放室溫，加入1ml不含抗生素的無菌恢復培養(yǎng)基（室溫），用1ml 槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后，轉移到50 ml離心管（BD Falcon 50 ml錐形離心管等），向離心管中補加恢復培養(yǎng)基（室溫）至10 ml。37℃，225 rpm復蘇60分鐘。

6. 5000 rpm離心一分鐘收菌，重懸后取100-200 μl涂布到含相應抗生素的LB（務必使用高鹽培養(yǎng)基平板，不可用2YT，SOB，SOC等低鹽培養(yǎng)基）平板上（因菌量較大，若全部涂板請選用直徑15cm培養(yǎng)皿2-5個）。將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36-48小時（培養(yǎng)24小時后可看到很小的克隆）