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Stbl4 Chemically Competent Cell

產(chǎn)品規(guī)格

Stbl4：                                                              100μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                         10μl

保存條件(保質(zhì)期)：                                  -80℃（6個(gè)月） 

基因型

F′ proAB+ lacIqZ?M15 Tn10 (Tet^R)mcrA ?(mcrBC-hsdRMS-mrr) recA1 endA1 gyrA96 gal- thi-1 supE44 λ- relA1?(lac-proAB)

Stbl4 Chemically Competent Cell產(chǎn)品說(shuō)明

Stbl4菌株來(lái)源于 Stbl2 E. coli strain，可用于慢病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建。Stbl4菌株適合克隆不穩(wěn)定插入片段 (正向重復(fù)序列，逆轉(zhuǎn)錄病毒序列等)；mcrA突變和mcrBC-hsd RMS-mrr deletion 使該菌株更適于克隆甲基化的基因組序列。recA 1和endA1的突變有利于克隆DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。lacI^qZΔM15標(biāo)記使得Stbl4菌株可用于藍(lán)、白斑篩選。此菌株具有四環(huán)素抗性。生產(chǎn)的Stbl4感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1×10⁸ cfu/μg DNA。

操作方法

1. Stbl4感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA（質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物）并用手打EP管底混勻，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

3. 向離心管中加入700 μl不含抗生素的無(wú)菌培養(yǎng)基 (LB)，混勻后37℃，200 rpm復(fù)蘇70分鐘。

當(dāng)質(zhì)粒中含有不穩(wěn)定片段時(shí)，30℃培養(yǎng)可降低錯(cuò)誤重組的概率，若轉(zhuǎn)化control pUC19計(jì)算轉(zhuǎn)化效率，則需37℃，225 rpm復(fù)蘇60分鐘

4. 5000 rpm離心1分鐘收集菌體，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基上，平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)17-20小時(shí)或30℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)20-24小時(shí)。若轉(zhuǎn)化control pUC19計(jì)算轉(zhuǎn)化效率，則需37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

5.若要獲得大量，高純度質(zhì)粒，建議在TB培養(yǎng)基中30度搖菌培養(yǎng)（以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒PUC19為例：500ml三角瓶中加入100ml TB營(yíng)養(yǎng)液，經(jīng)30度250rpm搖菌，可提取約100-200ug PUC19質(zhì)粒）

●TB 培養(yǎng)基配方
1.2%     Tryptone
2.4% Yeast Extract
4%        甘油
17mM   KH2PO4
72mM   K2HPO4
配制方法（1L）：
1，   配制磷酸緩沖液（0.17M  KH2PO4, 0.72M  K2HPO4）：
溶解2.31g KH2PO4和 12.54g K2HPO4于90ml去離子水中，定容到100ml，高壓滅菌。
2，在燒杯中加入以下試劑：Tryptone 12g， Yeast Extract    24g，甘油  4ml；加入去離子水800ml,充分溶解后，定容至900ml，高壓滅菌。
3，待溶液冷卻至60度以下，加入100ml 滅菌磷酸鹽緩沖液。

注意事項(xiàng)

1. 感受態(tài)細(xì)胞在冰中緩慢融化。插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間存

放會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?；蚋咝实倪B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少終用于涂板的菌量。