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伴放線放線桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒

Actinobacillus actinomycetemcomitans

產(chǎn)品及特點(diǎn)

伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)是一種革蘭陰性的球桿菌，該細(xì)菌可以引起一些嚴(yán)重的全身感染，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌還可能引起其他疾病,如心內(nèi)膜炎、心包炎、肺炎、菌血癥、敗血癥、骨髓炎、皮膚感染、尿路感染及各種膿腫等，此外，它還能產(chǎn)生如白細(xì)胞毒素、脂多糖、趨化抑制因子等多種毒力因子,這些毒力因子有利于細(xì)菌在宿主體內(nèi)定植、破壞組織、抑制組織修復(fù)、干擾宿主免疫反應(yīng)等，因此快速檢測伴放線放線桿菌具有重要意義。熒光定量PCR是檢測傳染性疾病的主流技術(shù)，本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測伴放線放線桿菌的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1.開即用，用戶只需要提供DNA模板。

2. 特異性高，引物是根據(jù)人伴放線放線桿菌高度保守區(qū)設(shè)計(jì),不會(huì)擴(kuò)增其他細(xì)菌

3.引物和擴(kuò)增體系經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性比常規(guī)PCR高100倍。

4.提供無傳染性的PCR陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

5.一管式操作，熒光PCR檢測，不容易產(chǎn)生環(huán)境污染。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研，本試劑盒足夠50次20μL體系的PCR。

伴放線放線桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸、-20℃保存，有效期一年。

自備試劑 樣品DNA。

使用方法 一、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供無傳染性的DNA段作為陽性對(duì)照。

1.標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

2.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

3.在7號(hào)管中加入5 μL 陽性對(duì)照（其濃度為1×10E8拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

 二、樣品 DNA 的制備

7.用自選方法純化樣品的DNA，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。

8. 如果有N個(gè)樣品，則需要進(jìn)行N+2個(gè)樣品提取，多出的一個(gè)用作樣品制備陽性對(duì)照管、另一個(gè)用作樣品制備陰性對(duì)照管。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送20次免DNA提取的天凈沙核酸釋放劑試用裝，該釋放劑的裂解液可以直接作為PCR模板，省略了DNA提取步驟

9.如果進(jìn)行定量分析，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。如果做定性分析，則6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品只選一個(gè)做（可以選4號(hào)，其余樣品不變）。以下只介紹定量分析的反應(yīng)設(shè)置。

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分：

11.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

 四、熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)

四、數(shù)據(jù)處理

12.設(shè)定60℃-96℃范圍的融解曲線分析，排除假陽性。

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等 于 40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為 陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則 為陰性，如果小于 40，則為陽性。