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供貨周期	一周	規(guī)格	50T
貨號	XY-0034	應(yīng)用領(lǐng)域	醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè)
主要用途	熒光定量PCR具有更高的擴增效率、更高的擴增靈敏度、更高的擴增特異性。

非洲馬瘟病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

African Horse Sickness Virus(AHSV)

產(chǎn)品及特點

非洲馬瘟病毒(African Horse Sickness Virus，AHSV)會引起非洲馬瘟，是一種馬屬動物的急性或亞急性傳染病，該病以發(fā)熱、皮下結(jié)締組織與肺水腫以及內(nèi)臟出血為特征，只能通過昆蟲傳播。馬對此病的易感性高，病死率高達 95%。本病發(fā)生有明顯的季節(jié)性和地域性，多見于溫熱潮濕季節(jié)，常呈地方流行或暴發(fā) 流行，傳播迅速，因此靈敏快捷的診斷產(chǎn)品具有重要的意義。本公司產(chǎn)品開發(fā)非洲馬瘟病毒染料法熒光定量 RT-PCR 試劑盒，它具有下列特點：

1. 一站式，用于不需要單獨準備每種成分，包括引物和對照。

2. 根據(jù)非洲馬瘟病毒的保守基因序列設(shè)計的引物，具有良好的特異性。

3. 基于染料法 qRT-PCR 檢測，靈敏度比常規(guī) RT-PCR 高 10-100 倍，可以達到至少 1000 拷貝/反應(yīng)。

4. 使用一管式 qRT-PCR 技術(shù)，RT 和 PCR 兩步在一個試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 30μL 體系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于臨床。

非洲馬瘟病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分

編號	成分	規(guī)格
試劑一	2×qRT-PCR 緩沖液	500 μL（棕色管）
試劑二	10×qRT-PCR 酶混合液	100 μL（紅蓋）
試劑三	ROX 染料 I，50×	20 μL（棕色管）
試劑四	ROX 染料 II，50×	20 μL（棕色管）
試劑五	熒光 PCR 模板稀釋液	1mL（黃蓋）
試劑六	非洲馬瘟病毒染料法 qRT-PCR 引物混合液	100 μL（白蓋）
試劑七	非洲馬瘟病毒染料法 qRT-PCR 陽性對照（1×10E8 拷貝/μL）	50 μL（黃蓋）
試劑八	天凈沙核酸釋放劑（試用裝）	20 次（1mL，綠蓋）
試劑九	使用手冊	1 份

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供 DNA 段作為陽性對照。

自備試劑樣品 DNA。

使用方法 一、稀釋陽性對照（以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

2. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

3. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。二、樣品 RNA 的制備

5. 如果有 N 個樣品，必須設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第 4 號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當于 1 萬拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。

6. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。本試劑盒免費贈送 20 次免 RNA 提取的天凈沙核酸釋放劑試用裝，

三、設(shè)置 RT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進行）

7. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號陽性對照稀釋液做模板）。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把 6 個標曲反應(yīng)縮減成 1 個，其余不變。

8. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設(shè) 置完畢后才設(shè)置陽性對照，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后后加）：

成分	N+2 個制備所得樣品	qRT-PCR 陰性對照	qRT-PCR 陽性對照（2-7 管）
2×qRT-PCR 緩沖液	10μL	10μL	各10μL
非洲馬瘟病毒染料法 qRT-PCR 引物混合物	2 μL	2 μL	各2 μL
50×ROX (見注)	0.4μL	0.4μL	各 0.4μL
樣品制備所得 RNA 模板（來于第 8 步）	5.6μL
稀釋所得 6 個陽性對照（來于第 6 步）			各 5.6μL（2 號樣到 2 號管，3 號樣到 3 號管…）
超純水		5.6μL
10×qRT-PCR 酶混合液	2μL	2μL	2μL

4. 上機進行 RT-PCR，RT-PCR 反應(yīng)參數(shù)為:2μL

過程	溫度	時間
RT（逆轉(zhuǎn)錄）	50℃	15-30 min
預(yù)變性	95℃	5 min
qRT - PCR 反應(yīng) （40 個循環(huán)））	95℃	15 sec
qRT - PCR 反應(yīng) （40 個循環(huán)））	58℃	1 min（采集 FAM 通道的熒光信號）

按儀器預(yù)設(shè)程序進行溶解曲線分析

四、數(shù)據(jù)處理

10. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

11. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。