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供貨周期	一周	規(guī)格	50T
貨號	XY-0196	應(yīng)用領(lǐng)域	醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè)
主要用途	熒光定量PCR具有更高的擴增效率、更高的擴增靈敏度、更高的擴增特異性。

河蟹顫抖病病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Chinese Mitten Crabs Trembling Disease Virus

產(chǎn)品及特點

河蟹顫抖病病毒(Chinese Mitten Crabs Trembling Disease Virus)是一種RNA病毒，會引起河蟹顫抖病，是當前危害河蟹嚴重的一種疾病，我國將其列為三類動物疫病，病蟹反應(yīng)遲鈍、行動遲緩，螯足的握力減弱，吃食減少以致不吃食；鰓排列不整齊、呈淺棕色、少數(shù)甚至呈黑色，血淋巴液稀薄、凝固緩慢或不凝固；典型的癥狀為步足顫抖、環(huán)爪、爪尖著地、腹部離開地面，甚至蟹體倒立。河蟹是該病的敏感種類，從體重3g的蟹種至300g以上的成蟹均可患病。3～11月為主要發(fā)病季節(jié)，嚴重發(fā)病地區(qū)發(fā)病率高達90%以上，死亡率在70%以上，對河蟹養(yǎng)殖業(yè)危害巨大，因此靈敏快捷的診斷產(chǎn)品具有重要的意義。本產(chǎn)品基于PCR原理開發(fā)。它具有下列特點：

1.一站式，用于不需要單獨準備每種成分，包括引物和對照。
2.根據(jù)河蟹顫抖病病毒的保守基因序列設(shè)計的引物，具有良好的特異性。
3.基于染料法qRT-PCR檢測，靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍，可以達到至少1000拷貝/反應(yīng)。
4.使用一管式qRT-PCR技術(shù)，RT和PCR兩步在一個試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。
5.本產(chǎn)品足夠50次30μL體系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于臨床。

河蟹顫抖病病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分

編號	成份	規(guī)格
試劑一	2×qRT-PCR 緩沖液	500 μL（棕色管）
試劑二	10×qRT-PCR酶混合液	100 μL（紅蓋）
試劑三	ROX染料I	50 μL（棕色管）
試劑四	ROX染料II	50 μL（棕色管）
試劑五	熒光PCR模板稀釋液	1mL（亮黃蓋）
試劑六	河蟹顫抖病病毒RT-PCR引物混合液	100 μL（白蓋）
試劑七	河蟹顫抖病病毒RT-PCR陽性對照（1×10E8拷貝/μL）	50 μL（黃蓋）
試劑八	天凈沙核酸釋放劑試用裝	20次（1mL，綠蓋）
試劑九	使用手冊	1份

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為12個月。陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供DNA段作為陽性對照。

自備試劑 樣品RNA

使用方法 一、稀釋陽性對照（以10E2-10E7這6個10倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原。
1.標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
2.在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
3.換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
4.換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品RNA的制備
5.如果有N個樣品，必須設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第4號（濃度為1×10E4拷貝/μL，10μL相當于1萬拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ铡?br />6.用自選方法純化N+2個樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置RT-PCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進行）
7.如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù)，則標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（用第4號陽性對照稀釋液做模板）。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把6個標曲反應(yīng)縮減成1個，其余不變。
8.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后后加）：

成分	N+2個制備所得樣品	RT-PCR陰性對照	RT-PCR陽性對照（2-7管）
2×qRT-PCR 緩沖液	10μL	10μL	各10μL
河蟹顫抖病病毒RT-PCR 引物混合物	2μL	2μL	各2μL
50×ROX (見注)	0.4μL	0.4μL	各0.4μL
樣品制備所得RNA模板（來于第8步）	5.6μL	不加	不加
稀釋所得6個陽性對照（來于第6步）	不加	不加	各5.6μL（2號樣到2號管，3號樣到3號管…）
10×qRT-PCR 酶混合液	2μL	2μL	2μL

9.上機后按下面參數(shù)進行RT-PCR（參數(shù)可能會因儀器不同而需優(yōu)化）。

過程	溫度	時間
RT（逆轉(zhuǎn)錄）	50℃	15-30分鐘
預(yù)變性	94℃	2分鐘
RT - PCR反應(yīng) （30個循環(huán)）	95℃	15 秒
	60℃	15 秒（采集FAM通道的熒光信號）
	72℃	15 秒
按儀器預(yù)設(shè)程序進行溶解曲線分析

四、數(shù)據(jù)處理
10.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
11.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。