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供貨周期	一周	規(guī)格	50T
貨號	XY-0203	應(yīng)用領(lǐng)域	醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè)
主要用途	熒光定量PCR具有更高的擴增效率、更高的擴增靈敏度、更高的擴增特異性。

沙眼衣原體染料法熒光定量PCR試劑盒

Chlamydia trachomatis

產(chǎn)品及特點

沙眼衣原體是一種微生物，目前發(fā)現(xiàn)它有 15 個血清型，不同的血清型能引起不同的疾病。沙眼衣原體是革蘭氏陰性菌，對許多抗生素、磺胺藥敏感，能抑制生長。能引起沙眼、包涵體包膜炎、性病淋巴肉芽腫等疾病。本公司開發(fā)沙眼衣原體染料法熒光定量 PCR 試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。

2. 引物根據(jù)沙眼衣原體專一區(qū)設(shè)計，特異性高。

3. 熒光定量 PCR 檢測，比常規(guī) PCR 更加靈敏。

4. 一管式閉管操作，降低了交叉污染。

5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。

6. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

沙眼衣原體染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

編號	成分	規(guī)格
試劑一	2×PCR MagicMix	500μL（棕色）
試劑二	熒光 PCR 模板稀釋液	1 mL（黃蓋）
試劑三	沙眼衣原體染料法 qPCR 引物混合液	100 μL（白蓋）
試劑四	沙眼衣原體染料法 qPCR 陽性對照(1×10E8 拷貝/μL)	50μL（紅蓋）
試劑五	使用手冊	1 份

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

自備試劑 樣品 DNA。

使用方法 一、稀釋 PCR 陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）

1. 注意：由于陽性對照濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 段作為陽性對照。

2. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。

4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

8. 如果有 N 個樣品，必須設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL PCR 陽性對照的 10000 倍稀釋的（稀釋后濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝，可以將 10μL 原液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，充分混勻，此為 100 倍稀釋液。再取 10μL 此稀釋液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，充分混勻，此為 10000 倍稀釋液）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。制備所得成為樣品 DNA。

9. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼容。

三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

10. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號陽性對照稀釋液，濃度為 14810 拷貝/μL）。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把 6 個標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 1 個，其余不變。

11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

成分	樣品管 N+2 個	PCR 陰性對照管	標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管（2-7 管）
2×qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各 10 μL
沙眼衣原體染料法 qPCR 引物混合液	2 μL	2 μL	各 2 μL
自備 10×ROX (見注)	2 μL	2 μL	各 2 μL
N+2 個待測樣品 DNA 模板	6 μL
自備超純水
第 7 步所得 PCR 陽性對照稀釋液（2-7 號）			各 6μL（2 號樣到 2 號管，3 號樣到 3 號管…）

12. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

過程	溫度	時間
預(yù)變性	95℃	5 min
PCR 反應(yīng) （40 個循環(huán)）	95℃	15 sec
PCR 反應(yīng) （40 個循環(huán)）	60℃	1 min（采集 SYBR 通道的熒光信號）

四、數(shù)據(jù)處理

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 cDNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct 值小于 40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。