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供貨周期	一周	規(guī)格	50T
貨號	XY-0279	應用領域	醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產業(yè),農業(yè)
主要用途	熒光定量PCR具有更高的擴增效率、更高的擴增靈敏度、更高的擴增特異性。

腸球菌通用染料法熒光定量PCR試劑盒

Enterococcus spp.

產品及特點

腸球菌(Enterococcus spp.)為革蘭陽性（G+）球菌，廣泛分布于自然環(huán)境及人和動物消化道內。20 世紀 80 年代以來，腸球菌嚴重感染的發(fā)生率和病死率明顯升高，并且由于腸球菌的固有耐藥和獲得性耐藥使許多常用抗菌藥物在治療腸球菌感染時失敗。因此快速靈敏檢測腸球菌具有重要意義本公司開發(fā)腸球菌通用染料法熒光定量 PCR 試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。

2. 引物根據腸球菌專一區(qū)設計，特異性高。

3. 熒光定量 PCR 檢測，比常規(guī) PCR 更加靈敏。

4. 一管式閉管操作，降低了交叉污染。

5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應體系的熒光定量 PCR。

6. 本產品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

腸球菌通用染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

編號	成分	規(guī)格
試劑一	2×PCR MagicMix	500μL（棕色）
試劑二	熒光 PCR 模板稀釋液	1 mL（黃蓋）
試劑三	腸球菌通用染料法 qPCR 引物混合液	100 μL（白蓋）
試劑四	腸球菌通用染料法 qPCR 陽性對照(1×10E8 拷貝/μL)	50μL（紅蓋）
試劑五	使用手冊	1 份

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

自備試劑 樣品 DNA。

使用方法 一、稀釋 PCR 陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）

1. 注意：由于陽性對照濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 段作為陽性對照。

2. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。

4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

7. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

8. 如果有 N 個樣品，必須設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL PCR 陽性對照的 10000 倍稀釋的（稀釋后濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當于 1 萬拷貝，可以將 10μL 原液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，充分混勻，此為 100 倍稀釋液。再取 10μL 此稀釋液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，充分混勻，此為 10000 倍稀釋液）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。制備所得成為樣品 DNA。

9. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數核酸提取試劑盒兼容。

三、設置 qPCR 反應（20 μL 體系，在樣品制備室進行）

10. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號陽性對照稀釋液，濃度為 14810 拷貝/μL）。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把 6 個標曲反應縮減成 1 個，其余不變。

11. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

成分	樣品管 N+2 個	PCR 陰性對照管	標準曲線樣品管（2-7 管）
2×qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各 10 μL
腸球菌通用染料法 qPCR 引物混合液	2 μL	2 μL	各 2 μL
自備 10×ROX (見注)	2 μL	2 μL	各 2 μL
N+2 個待測樣品 DNA 模板	6 μL
自備超純水
第 7 步所得 PCR 陽性對照稀釋液（2-7 號）			各 6μL（2 號樣到 2 號管，3 號樣到 3 號管…）

12. 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 PCR（具體 PCR 參數可以根據儀器不同而自行優(yōu)化）。

過程	溫度	時間
預變性	95℃	5 min
PCR 反應（40 個循環(huán)）	95℃	15 sec
PCR 反應（40 個循環(huán)）	60℃	1 min（采集 SYBR 通道的熒光信號）

四、數據處理

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 cDNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。若重復結果 Ct 值小于 40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。