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供貨周期	一周	規(guī)格	50T
貨號	XY-0294	應用領(lǐng)域	醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè)
主要用途	熒光定量PCR具有更高的擴增效率、更高的擴增靈敏度、更高的擴增特異性。

馬鼻肺炎病毒探針法熒光定量PCR試劑盒

Equine Rhinopneumonitis Virus(ERV)

產(chǎn)品及特點

馬鼻肺炎病毒(Equine Rhinopneumonitis Virus，ERV)會引起馬鼻肺炎，又名馬病毒性流產(chǎn)，是馬的一種急性發(fā)熱性傳染病，在自然條件下只感染馬屬動物。病馬和康復后的帶毒馬是傳染源，主要經(jīng)呼吸道傳染，消化道及交配也可傳染，可呈地方性流行，多發(fā)生于秋冬和早春。妊娠母馬感染本病時，易發(fā)生流產(chǎn)；幼駒發(fā)病初期高熱，體溫高達 39.5-41℃，可持續(xù) 2-7 天，同時可見鼻粘膜充血并流出漿液性鼻液，頜下淋巴結(jié)腫大，食欲稍減，體溫下降后可恢復正常，若發(fā) 病后調(diào)教或勞役過度，易引起細菌繼發(fā)感染，發(fā)生肺炎和腸炎等，造成死亡。該病毒容易給馬場養(yǎng)殖業(yè)造成較大經(jīng)濟損失，因此馬鼻肺炎病毒的快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用，本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎開發(fā)的專門檢測馬鼻肺炎病毒的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據(jù)馬鼻肺炎病毒高度保守區(qū)設計，不會跟其他病毒 DNA 發(fā)生交叉反應。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研。

馬鼻肺炎病毒探針法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

編號	成分	規(guī)格
試劑一	2×Probe qPCR MagicMix	500 μL（本色蓋）
試劑二	熒光 PCR 模板稀釋液	1 mL（黃蓋）
試劑三	馬鼻肺炎病毒探針法 qPCR 引物混合液	100 μL（白蓋）
試劑四	馬鼻肺炎病毒 qPCR 探針	50 μL（棕色管）
試劑五	馬鼻肺炎病毒探針法 qPCR 陽性對照 (1×10E8 拷貝/μL)	50 μL（黃蓋）
試劑六	使用手冊	1 份

運輸及保存 低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。

自備試劑 DNA 模板、10×ROX（根據(jù)機型決定，具體見使用方法）。

使用方法 一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7. 如果有 N 個樣品，好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。

三、Probe qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

成分	樣品管 N+2個	PCR陰性對照管	標準曲線樣品管（2-7管）
2×Probe qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各10 μL
馬鼻肺炎病毒qPCR探針	1 μL	1 μL	各1 μL
馬鼻肺炎病毒探針法qPCR引物混合液	2 μL	2 μL	各2 μL
N+2個待測DNA模板	7 μL	不加	不加
超純水	不加	7 μL	不加
第7步所得標準曲線樣品稀釋液（2-7號）	不加	不加	各7 μL（2號樣到2號管，3號樣到3號管…）

11.蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行PCR：

過程	溫度	時間
預變性	95℃	3 min
PCR反應（40個循環(huán)）	95℃	15sec
PCR反應（40個循環(huán)）	60℃	1 min（采集 FAM 通道的熒光信號）

四、數(shù)據(jù)處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。若重復結(jié)果 Ct 值小于 40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。