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埃希氏菌通用染料法熒光定量PCR試劑盒

Escherichia spp.

產(chǎn)品及特點(diǎn)

大腸埃希氏菌，俗稱大腸桿菌（Escherichia coli），屬于革蘭氏陰性細(xì)菌。 大腸桿菌 O157:H7 是腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)的常見(jiàn)類型，O 表示抗原類型, H7 表示血清型。其感染劑量極低， 人體只要攝入 10 個(gè)細(xì)菌就可以致病，目前還沒(méi)有*疫苗，因此大量開展預(yù)防 檢測(cè)工作具有重要的意義。目前對(duì) O157 的檢測(cè)主要是傳統(tǒng)分離培養(yǎng)、免疫學(xué) 和分子水平的 PCR 檢測(cè)。本試劑盒就是利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)開發(fā)的大 腸桿菌 O157:H7 檢測(cè)試劑盒，它通過(guò)熒光染料實(shí)時(shí)顯示樣品模板 DNA 的量， 并通過(guò)坐標(biāo)曲線表示出來(lái)，結(jié)果直觀準(zhǔn)確。它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品模板，操作簡(jiǎn)單，定量準(zhǔn)確快速。

2. 熒光定量 PCR 檢測(cè)，反應(yīng)特異性強(qiáng)。

3. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。 

埃希氏菌通用染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。

自備試劑   樣品等

使用方法 一、樣品 DNA 的制備 用自選方法提取細(xì)菌樣品 DNA。注意：DNA 純化方法是決定檢測(cè)靈敏度的 關(guān)鍵因素。如果不能很好純化樣品 DNA，后面的 PCR 再靈敏也不能提高整體檢 測(cè)靈敏度。

二、制備 O157:H7 標(biāo)準(zhǔn)曲線（以 10-10E6 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo) 準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣 品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品 不提供活體病毒做陽(yáng)性對(duì)照，只提供沒(méi)有傳染性的、可以直接使用的 DNA 段 作為陽(yáng)性對(duì)照。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 6，5，4，3，2 和 1 號(hào)。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 超純水（用帶芯槍頭，下同）。

3. 先將本試劑盒提供的陽(yáng)性對(duì)照用 TE 緩沖液或超純水 10 倍梯度稀釋到 10E7 拷貝/μL（注：請(qǐng)不要將本試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品一次性稀釋至 10E7 拷貝/μL，建議每次稀釋 10 倍，梯度稀釋至 10E7 拷貝/μL）。

4. 在 6 號(hào)管中加入 5 μL 10E7 拷貝/μL 的 O157:H7 陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。

5. 換槍頭，從 6 號(hào)管中取 5 μL 溶液到 5 號(hào)管中，充分震蕩 1 分鐘，得 10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。

6. 換槍頭，從 5 號(hào)管中取 5 μL 溶液到 4 號(hào)管中，重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。

7. NC 管中不加任何陽(yáng)性對(duì)照。

8. 從 1-6 號(hào)管中分別取 5 μL 和待測(cè)樣品一起進(jìn)行定量 PCR（見(jiàn)下步），每個(gè) 樣品做 3 次重復(fù)。PCR 后得到每個(gè)陽(yáng)性對(duì)照稀釋樣品的熒光 PCR Ct 值， 并以之為縱軸，以濃度的對(duì)數(shù)值為橫軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

三、PCR 檢測(cè)（20 μL 體系）

1. 在 PCR 管中加入下列成分（待測(cè)樣品需要做三次重復(fù)，下表只列出一次）

2. 建議 PCR 反應(yīng)參數(shù)（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化） 

3. 數(shù)據(jù)采集

具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合 DNA 時(shí)，大吸收光譜在 471 nm，結(jié)合 DNA 時(shí)的大吸收光譜在 500 nm， 大發(fā)射光譜在 530 nm。

四、數(shù)據(jù)處理

以 O157:H7 陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線。再以待測(cè)樣品濃度的 log 為橫軸，以 Ct 值為縱軸，通過(guò)待測(cè)樣品的 Ct 值 計(jì)算出樣品 DNA 的濃度。